Рентгеновская кристаллография является доминирующим методом для определения 3D структурной информации из белков. Линии синхротронного луча необходимы для получения данных из небольших, слабо диффрактных кристаллов, которые производят белки. Массивная линия представляет собой уникальную линию луча, поскольку полностью автоматизирует процесс сбора данных с биологических макромолекул.
Из выборки монтажа, местоположения и окончательного сбора данных. Полная автоматизация такого рода очень важна, так как позволяет исследователям проводить время в лаборатории, а не собирать данные на линии луча. Линия луча также умна и в среднем может собирать лучшие данные, чем когда линия луча управляется людьми.
Чтобы начать этот протокол, выполните кристаллическое монтажное и запросите время луча на Massive, как описано в текстовом протоколе. Перейдите на информационную систему для белковых кристаллических лучей, или веб-сайт ISPyB. Выберите эксперименты MX, воймить с номером эксперимента и паролем.
Нажмите на отгрузку, добавьте новую и предоставьте необходимую информацию. Затем нажмите сохранить. Нажмите добавить посылку и заполнить запрашиваемую информацию.
Нажмите сохранить, а затем нажмите добавить контейнер. Дайте шайбе штрих-код в качестве имени, и выбрать позвоночник шайбу, снова нажмите сохранить. Нажмите на символ контейнера и редактировать, и заполнить необходимую информацию о образцах, таких как название белка, предпочтительный поток работы, и кристаллическое положение, в шайбе.
Выберите белок, одобренный группой безопасности ESRF. Введите уникальное имя образца для идентификации каждого отдельного образца. По желанию сканируйте штрих-код пин-кода.
Остальная часть информации, которую нужно включить, также необязательна. Для каждого отдельного образца введите тип эксперимента. Это определяет, какой автоматический рабочий процесс будет использоваться для обработки каждого кристалла.
Учитывая, что кристаллы GCSH являются иглами, выберите MX нажмите P.Next, введите космическую группу. При наличии этого средства они будут использоваться для расчетов стратегии сбора данных и автоматических линий обработки данных. Введите нужное разрешение.
Это определяет расстояние кристалла до детектора от первоначального сканирования сетки, характеристики и сбора данных по умолчанию. Теперь установите желаемое пороговое разрешение, чтобы предотвратить сбор полных наборов данных из кристаллов, которые не диффрактировать до этого предела. Это может сэкономить место для хранения данных и проанализировать время.
Установите требуемую полноту. Затем установите требуемую множественность. Если на поддержке образца содержится более одного кристалла, установите максимальное количество кристаллов, которые будут проанализированы.
Значение по умолчанию составляет один или пять для MX нажмите P.Соответствующий размер луча также может быть выбран. Поместите в космическую группу, если это известно, в столбец космической группы силы. Затем установите радиационную чувствительность кристаллов.
При желании установите общий угол вращения, который будет собран для полного сбора набора данных. После ввода всей информации в систему сохраните значения. Нажмите на кнопку, вернитесь к отгрузкам и нажмите отправить отгрузку в ESRF.
Печать этикетки доставки и отправить образцы. Пользователи должны организовать доставку с курьером, используя данные учетной записи ESRF. В день эксперимента образцы передаются в Массивный роса высокой емкости.
Затем ученые линии луча запускают сбор данных, за которым могут следить пользователи удаленно. Для каждого типа выборки пользователи получают электронное письмо, информирующее их о том, что сбор данных начался. Выполнение всех этапов во всех рабочих процессах можно следить онлайн и в режиме реального времени.
Это доступно для пользователя, войдя в ISPyB. Результаты также можно просматривать и загружать. Для каждого анализируемого образца изучите результаты автоматического эксперимента на ISPyB.
Нажмите на нужную экспериментальную сессию на ID30A1. Выберите предпочтительный конвейер автоматической обработки. Загрузите данные, написанные в правильной космической группе с высочайшей полнотой и высоким разрешением.
Нажав на последние результаты сбора, а затем скачать. Рабочий процесс MX press P использовался линией луча ESRF Massive, чтобы полностью автоматически монтировать, центр в рентгеновском луче, характеризовать и собирать полные наборы данных дифракции из серии кристаллов человека GCSH. Образцы были смонтированы и петля проанализирована для области для сканирования.
После дифракционных анализов для сбора данных в кристалле было выбрано четыре точки. Ручное определение структуры путем молекулярной замены дало карту плотности электронов высокого качества после одного автоматизированного цикла уточнения. Для этого набора данных автоматизированный конвейер вырезал данные в одной точке три два разрешения ангстрема.
Тем не менее, пользователи могут принять решение о сокращении данных в более низком разрешении. Непрерывная плотность электронов видна для всей аминокислотной цепи, кроме этерминального гистидина. Из четырех замен, которые отличают человека и крупного рогатого скота GCSH, три легко идентифицировать в плотности электронов.
Это менее ясно для аспарагиновой кислоты лизина 125 замены. Для которых плотность электрона боковой цепи только частично разрешена из-за гибкости. Полученная в настоящее время модель имеет значение R работы 20 точки четыре процента и R бесплатное значение 23 точки восемь процентов и может быть дополнительно оптимизирована за счет дополнительных циклов автоматизированного и ручного построения модели и уточнения.
Важно адаптировать требования к вашей системе. Например, установка уже наблюдаемого разрешения на известное значение может сэкономить время и обеспечить более эффективное сбор данных. Полностью автоматический сбор данных демократизировал кристаллографию, и теперь даже небольшие лаборатории могут приступить к знаменитому проекту, когда это было возможно раньше только с огромной силой человека.
