Этот метод может помочь расшифровать шаги в обмене нитей ДНК и показывает роль молекул различных белков, участвующих в комбинации во время ремонта. С помощью этого метода мы можем контролировать обмен нити ДНК в режиме реального времени без каких-либо нарушений реакции и использовать операционную для определения кинетики каждого шага реакции. С некоторыми незначительными корректировками, этот метод может быть применен для изучения деятельности очищенных белков рекомбинации, полученных из других видов, таких как млекопитающие и растения.
Демонстрация процедуры будет Кентаро Ито, почтовый док из моей лаборатории. Для начала подготовьте буфер реакции А в соответствии с текстовым протоколом. Затем добавьте 36-наномол 16FA-олигонуклеотид в буфер для анализа спаривания ДНК.
Инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Добавьте белок RAD-51 при конечной концентрации 1,5 микро молей в смесь и инкубировать его при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Добавьте белок SWI5-SFR1 при конечной концентрации 0,15 микро молей в смесь и инкубировать его при 37 градусах по Цельсию в течение еще пяти минут.
Передача 1,5 миллилитров смеси в 1,0 на 1,0 см кварцевой кюветт, содержащий магнитный мешалка. Вставьте кювет в спектрофторометр и приступайте к регулировке контроллера температуры и магнитного мешалки. Запись изменения в FAM флуоресценции выбросов на 525 нанометров при возбуждении на 493 нанометров с интервалом в одну секунду в течение 100 секунд.
Наконец, со шприцем, вводить ROX помечены двойной мель ДНК в окончательной концентрации 36 нано молей в кювет. Запись изменения флуоресценции выбросов с интервалом в одну секунду в течение 30 минут. Чтобы сравнить спектры флуоресценции между субстратами и конечные продукты, вставьте каждый кюветт, содержащий 16 FA-oligonucleotides с или без RAD-51 в спектрофторометр и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут.
Затем завездните флуоресценцию FAM на 500-600 нанометрах при возбуждении на 493 нанометров. Чтобы проверить влияние RAD-51 на спектры флуоресценции, добавьте RAD-51 при конечной концентрации 1,5 микро молей. И инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Наконец, завестить спектры флуоресценции от 500 до 600 нанометров при возбуждении на 493 нанометров. Максимальная эффективность FRET получена путем измерения максимального снижения интенсивности флуоресценции, когда все однострунные подложки ДНК преобразуются в двухструнный ДНК в анализе спаривания. Или путем измерения максимального увеличения интенсивности, когда все двухструнный субстрат ДНК преобразуется в однострунный ДНК в анализе смещения.
В обоих анализах добавление белка RAD-51 не повлияло на флуоресцентный выброс ФАМ или его эффективность закалки породами. Последствия спонтанных реакций между субстратом ДНК и последующим отбеливанием фотографий невелики. Как показали незначительные изменения в выбросах ФАМ без RAD-51, по сравнению с существенными изменениями, замеченные с RAD-51.
Добавление комплекса SWI5-SFR1 сильно стимулирует парную активность RAD-51. Реакция сопряжения моделируется с помощью трехшаговой модели, состоящей из формирования первого трехтягового промежуточного, перехода во второй промежуточный и выпуска одноявенной ДНК и формирования гетеро дуплекса. Сравнение трехшаговой модели с двухшаговой моделью указывает на то, что трехшаговая модель лучше подходит для моделирования сопряжения ДНК без или со комплексом SWI5-SFR1.
Расчетная равновесная константа каждого шага реакции, с или без SWI5-SFR1, показывает, что комплекс SWI5-SFR1 не стимулирует образование первого трехтягового промежуточного, но сильно стимулирует переход между двумя трехтягами промежуточными и высвобождением ДНК СС. Необходимо убедиться, что каждая партия очищенного белка не содержит нуклеазы и геликейсного загрязнения.
