Анализы захвата и расширения D-петли являются первыми, которые позволяют непредвзятое и прямое количественное определение стадий формирования и расширения D-петли во время гомологичной рекомбинации в митотически растущих дрожжевых клетках. Этот независимый метод жизнеспособности позволяет изучать белки в метаболизме D-петли, которые в противном случае было бы невозможно отделить от более поздних ролей, просто глядя на продукты BIR. В будущем мы планируем перенести эти анализы на клетки человека, чтобы лучше понять роль ключевых белков, включая BRCA2 и кило случаи Блума и Уорнера в гомологичной рекомбинации.
Начните с центрифугирования образцов в течение пяти минут. Повторно суспендируют гранулу в 2,5 миллилитрах 1x раствора псоралена и переложат ее в чашку Петри размером 60 на 15 миллиметров. Для отсутствия контроля сшивания повторно суспендируйте гранулу в 2,5 миллилитрах раствора TE1.
Далее установите источник ультрафиолетового света сверху в орбитальный шейкер, установленный на 50 об/мин. Для сшивки образцов используется УФ-сшиватель с колбами длиной 365 нанометров. Расположите чашку Петри на один-два сантиметра ниже источника ультрафиолетового света в течение 10 минут с легким встряхиванием на предварительно охлажденной пластиковой или плексигласовой пластине.
Затем переложите образец в новую 15-миллилитровую трубку. Промыть чашку Петри 2,5 миллилитрами раствора TE1 и добавить ее в пробирку. Центрифугируйте образцы в течение пяти минут.
Выбросьте супернатант и храните гранулы при минус 20 градусах Цельсия. Поместите образцы на лед для таяния. Одновременно разогрейте сухую ванну до 30 градусов цельсия.
Повторно суспендируйте образцы в одном миллилитре сферопластического буфера и перенесите их в 1,5-миллилитровые микроцентрифужные трубки. Затем добавьте 3,5 микролитра раствора зимолиазы и аккуратно перемешайте постукиванием. Инкубировать при температуре 30 градусов Цельсия в течение 15 минут.
А затем поместите трубки на лед. Центрифугируйте в течение трех минут и поместите образцы на лед. Трижды промыть образцы в одном миллилитре сферопластирующего буфера и центрифугировать образцы в течение трех минут.
Повторное суспендирование образцов в одном миллилитре ферментного буфера холодной рестрикции. Центрифугируйте в течение трех минут и поместите образцы на лед. Повторите стирку один раз.
Повторное суспендирование образцов в одном миллилитре холодного 1x рестрикционного ферментного буфера. Разделите образец поровну на две части. Центрифугируйте образцы в течение трех минут при 16 000 G при четырех градусах Цельсия.
Повторно суспендировать одну трубку из каждого образца в 180 микролитрах 1,4-кратного ферментного буфера рестрикции с гибридизирующими олиго и другую трубку в 180 микролитрах 1,4-кратного ферментного буфера рестрикции без гибридизации олиго. Заморозьте образцы в жидком азоте. Разморозьте образцы на льду.
Разогрейте одну сухую ванну до 65, а другую до 37 градусов цельсия. Aliquot 36 микролитров образца в новую микроцентрифужную трубку и четыре микролитра 1%SDS и смешивают, осторожно постукивая по боковой стороне трубки. Инкубировать при температуре 65 градусов Цельсия в течение 15 минут с нежным постукиванием каждые пять минут.
Поместите образцы на лед сразу после инкубации. Добавьте 4,5 микролитра 10% Triton X-100 и перемешайте путем пипетки. Добавьте к каждому образцу от 20 до 50 единиц высокоточного фермента рестрикции EcoR1 или HindIII.
И инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение одного часа с легким перемешиванием каждые 20-30 минут. За это время предварительно разогреть сухую ванну до 55 градусов цельсия и водяную баню до 16 градусов по Цельсию. Добавьте 8,6 микролитров 10% SDS к каждому образцу и перемешайте путем пипетки и нарезания резьбы.
Инкубировать при 55 градусах Цельсия в течение 10 минут. Добавьте 80 микролитров 10% Triton X-100 к каждому образцу и перемешайте путем пипетирования. Добавьте 660 микролитров 1x лигационного буфера без АТФ, один миллимоляр АТФ при рН 8,0 и восемь единиц Т4-лигазы ДНК к каждому образцу и аккуратно перемешайте путем инверсии.
Инкубировать 16 градусов Цельсия в течение 1,5 часов с инверсией каждые 30 минут. Поместите образцы на лед сразу после инкубации. После очистки ДНК, как описано в протоколе, используйте два микролитра очищенной ДНК для создания 20-микролитровой реакции qPCR в соответствии с инструкциями производителя.
Для каждого образца настройте пять контрольных реакций и одну реакцию количественной оценки и запустите их в двух экземплярах. Анализ DLC через два часа после двухцепочечного разрыва или индукции DSB показал, что сшивка псораленов имеет решающее значение, а эффективность зависит от времени между сбором проб и qPCR. Значения ARG4 Cp были одинаковыми между сшитыми образцами, но ниже для образца без сшивки, поскольку ДНК без перекрестных связей амплируется более эффективно.
Для всех образцов контроль межмолекулярного лигирования qPCR находился в пределах диапазона. Надежная индукция DSB была подтверждена низким сигналом qPCR для контроля, который усиливается через сайт распознавания эндонуклеазы HO. Аналогичные результаты наблюдались для контроля EcoR1 qPCR.
Сигнал DLC с гибридизирующим олиго рассчитывали путем нормализации до контроля межмолекулярного лигирования. Анализ DLE, выполненный через шесть часов после индукции DSB, показал, что значения ARG4 CP были одинаковыми между образцом с гибридизацией олиго и без него. Контроль qPCR межмолекулярной перевязки выявил приемлемый сигнал для образца с гибридизацией олигоса и без него, но более низкий сигнал для неисправного образца.
Во всех трех образцах была сильная индукция DSB. Так как расщепление HindIII зависит от восстановления участка фермента рестрикции гибридизирующим олиго. Наблюдалась значительная разница в амплификации по всему участку расщепления HindIII на резецированной нити между шириной и без образцов олиго.
Наблюдалась меньшая разница в усилении по всему участку на протяженной нити, потому что здесь расщепление HindIII также зависит от расширения. Образцы и буфер должны постоянно оставаться холодными. Образцы должны быть заморожены после повторного суспензии в 1,4-кратном буфере фермента холодной рестрикции с гибридизирующими олиго или без них.
Влияние после образования и расширения D-петли на образование продукта может быть изучено с использованием южного блоттинга или генетических анализов конечных точек. Влияние на поиск гомологии может быть исследовано с использованием высокого CP. Хроматин-иммунопреципитация может предоставить информацию о рекрутировании интересующего белка.
