Questo metodo può aiutare a decifrare i passaggi nello scambio di filamenti di DNA e rivela i ruoli molecolari di diverse proteine coinvolte nella combinazione durante la riparazione. Con questa tecnica possiamo monitorare lo scambio di filamenti di DNA in tempo reale senza alcuna interruzione della reazione e utilizzare la sala operatoria per determinare la cinetica di ogni fase di reazione. Con alcune piccole regolazioni, questa tecnica può essere applicata per studiare le attività delle proteine purificate di ricombinazione derivate da altre specie, come mammiferi e piante.
A dimostrare la procedura sarà Kentaro Ito, un Post Doc del mio laboratorio. Per iniziare, preparare il buffer di reazione A in base al protocollo di testo. Quindi, aggiungere 36 nanomole 16FA-oligonucleotide al tampone per il test di accoppiamento del DNA.
Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Aggiungere la proteina RAD-51 a una concentrazione finale di 1,5 micro talpe alla miscela e incubarla a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Aggiungere la proteina SWI5-SFR1 a una concentrazione finale di 0,15 micro talpe alla miscela e incubarla a 37 gradi Celsius per altri cinque minuti.
Trasferire 1,5 millilitri della miscela in una cuvetta al quarzo da 1,0 per 1,0 cm contenente un agitatore magnetico. Inserire la cuvetta in uno spettrofluorometro e procedere alla regolazione del regolatore di temperatura e dell'agitatore magnetico. Registrare il cambiamento nell'emissione di fluorescenza FAM a 525 nanometri all'eccitazione a 493 nanometri a intervalli di un secondo per 100 secondi.
Infine, con una siringa, iniettare IL DNA a doppio filamento etichettato ROX ad una concentrazione finale di 36 nano talpe nella cuvetta. Registrare la variazione dell'emissione di fluorescenza a intervalli di un secondo per 30 minuti. Per confrontare gli spettri di fluorescenza tra i substrati e i prodotti finali, inserire ogni cuvetta contenente i 16 FA-oligonucleotidi con o senza RAD-51 in uno spettrofluorometro e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Quindi, registrare l'emissione di fluorescenza FAM a 500-600 nanometri all'eccitazione a 493 nanometri. Per testare l'effetto di RAD-51 sugli spettri di fluorescenza, aggiungere RAD-51 ad una concentrazione finale di 1,5 micro talpe. E incubare la miscela a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Infine, registrare gli spettri di fluorescenza da 500 a 600 nanometri all'eccitazione a 493 nanometri. La massima efficienza FRET si ottiene misurando la massima riduzione dell'intensità di fluorescenza quando tutto il substrato di DNA a singolo filamento viene convertito in DNA a doppio filamento nel saggio di accoppiamento. Oppure misurando l'aumento massimo dell'intensità quando tutto il substrato di DNA a doppio filamento viene convertito in DNA a singolo filamento nel saggio di spostamento.
In entrambi i test, l'aggiunta della proteina RAD-51 non ha influenzato l'emissione di fluorescenza della FAM, o la sua efficienza di tempra da parte delle rocce. Gli effetti delle reazioni spontanee tra i DNA del substrato e il successivo sbiancamento fotografico sono piccoli. Come dimostrano le variazioni trascurabili nell'emissione di FAM senza RAD-51, rispetto alle sostanziali variazioni osservate con RAD-51.
L'aggiunta del complesso SWI5-SFR1 stimola fortemente l'attività di accoppiamento di RAD-51. La reazione di accoppiamento è simulata usando un modello a tre fasi, costituito dalla formazione del primo intermedio a tre filamenti, dalla transizione nel secondo intermedio e dal rilascio del DNA a singolo filamento e dalla formazione dell'etero duplex. Un confronto del modello in tre step con un modello in due step indica che il modello in tre step è più adatto per simulare l'accoppiamento del DNA, senza o con il complesso SWI5-SFR1.
La costante di equilibrio calcolata di ogni fase di reazione, con o senza SWI5-SFR1, mostra che il complesso SWI5-SFR1 non stimola la formazione del primo intermedio a tre filamenti, ma stimola fortemente la transizione tra i due intermedi a tre filamenti e il rilascio di DNA SS. È essenziale verificare che ogni lotto di proteine purificate sia privo di nucleasi e contaminazione da elicase.
