Кохлеарный поверхностный препарат позволяет визуализировать весь хрусталик органа Корти с помощью иммуногистохимии и конфокальной визуализации. Он широко используется для исследования конкретных кохлеарных патологий, представляющих интерес. Мы изменим метод микродиссеции кохлеарных.
Основным преимуществом этого метода является присоединение куска кохлеарного эпителия к 10-миллиметровым круглым крышкам для процедуры иммунолабеля, избегая при этом потери тканей во время многочисленных шагов стирки. Кроме кохлеарных патологий, кохлеарная подготовка поверхности также может быть использована для оценки экспрессии и регенерации волосяных клеток. Основные навыки микроскопа необходимы для этой техники и визуальной демонстрации метода может помочь гарантировать, что каждый шаг выполняется правильно.
Демонстрация процедуры будет Цяоцзюнь Фан, аспирант из моей лаборатории. Для извлечения височной кости, немедленно посмертно вытяните кожу передней подвергать кости черепа и использовать ножницы, чтобы вырезать кость из заднего аспекта вперед вдоль центральной линии черепа. Используйте миппы для удаления ткани мозга перед использованием большого и указательного пальцев, чтобы вручную удалить височные кости у мышей в возрасте трех месяцев и старше.
Поместите кости в чашку Петри диаметром 30 миллиметров, содержащую свежий ледяной 4%PFA и PBS под микроскопом вскрытия и удалите стапы из овального окна. Проколите круглую оконную мембрану с миппами номер пять и используйте 27 калибровочной иглы, прикрепленной к одному миллилитровому шприцу, содержащем свежие 4%PFA, чтобы сделать небольшое отверстие в вершине улитки. Аккуратно и медленно пронизывают улитку с фиксаторным раствором через круглые и овальные окна, пока раствор не вымывается из небольшого отверстия на вершине.
Затем перенесите до двух пропитанных улитки в отдельные 20 миллилитров сцинтилляционных флаконов, содержащих 10 миллилитров по 4%PFA на флакон и осторожно агитировать образцы в течение двух часов при комнатной температуре, а затем на ночь хранения при четырех градусах по Цельсию на ротатор. На следующее утро, мыть улитки с тремя пятиминутные моет со свежим PBS за стирку. После последней стирки добавьте 20 миллилитров по 4%EDTA к каждому флакону и поверните образцы в течение 48 часов при четырех градусах Цельсия с нежным возбуждением.
В конце инкубации коснитесь костной вестибулярной части каждой улитки с помощью типсов для оценки эластичности образцов. Если кости упругие, а не твердые, улитка была декальцифицирована. Замените EDTA для каждого образца свежим PBS.
Для микроперепись кохлеарного эпителия, схватить вестибулярной части височной кости с миппами и использовать скальпель, чтобы сократить апический поворот под углом 45 градусов. Вырезать вертикально вдоль слабой линии между круглым окном и овальным окном, чтобы отделить улитку от вестибулярной части и сориентировать кохлеарную часть с базальным поворотом в сторону нижней и средней поворотов к верхней части чашки Петри. Из этого положения, вырезать костлявую капсулу и боковой стенки среднего поворота к концу, из которого апический раздел был удален и продолжать резки полностью отделить среднюю часть от базальных и крючок регионов.
Размещение базальной и крючок часть с базилярной мембраны сайт, ориентированный на дно блюда, вертикально сократить medialis от области крючка, чтобы удалить medialis и сократить базальные и крючок регионов, чтобы отделить часть крючка. Чтобы избежать искажения ткани, отрежьте medialis от области крючка перед разделением базального поворота и области крючка. Отрежьте относительно большие части костной капсулы и боковой стенки ткани среднего поворота и удерживая боковую стенку с типсами, чтобы выровнять костлявую капсулу и боковую стенку с нижней частью чашки Петри, вырежьте эти ткани со стороны базилярной мембраны.
Затем сровняйте образец, чтобы сориентировать сенсорную поверхность волосяной клетки вверх и обрезать остальную часть костлявой капсулы и боковой стенки. Затем используйте типсы, чтобы удалить текториальную мембрану, чтобы полностью отделить среднюю область и удалить костлявую капсулу, ткани боковой стенки и текторные области остальных поворотов, как это только что продемонстрировано. Когда все кохлеарные повороты были вскрыты, выложить 0,5 микролитров клеточного и тканевого клея на центр одного круглого 10-миллиметрового крышки и позволить клею высохнуть в течение трех-пяти минут при комнатной температуре.
Поместите высушенные крышки в чашку Петри и вставьте все четыре части каждого сенсорного образца эпителия на одну крышку. Затем используйте типсы, чтобы схватить один край каждого крышки для передачи образцов в отдельные колодцы из четырех хорошо клеточной культуры блюдо для иммунолабеля. Для иммунолабеля поверхностных кохлеарных препаратов синапса, мыть каждый сенсорный эпителий три раза в течение пяти минут в свежем PBS за стирку, а затем лечение каждого образца с двумя миллилитров 2%неионной сурфактант в течение 30 минут при комнатной температуре на ротатор.
В конце инкубации, аспирировать серфактант раствор из каждой хорошо и блокировать любые неспецифические связывания с 100 микролитров блокирующего раствора на колодец в течение одного часа на ротатор с нежным возбуждением при комнатной температуре. В конце блокирующего инкубации, мыть образцы три раза с PBS, как попродемонстрировано под нежным волнением перед маркировкой каждого эпителия с 100 микролитров первичных антител, представляющих интерес в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия защищены от света. На следующий день, мыть образцы три раза со свежим PBS и нежное возбуждение на стирку и этикетки образцов с 100 микролитров соответствующих вторичных антител, представляющих интерес в течение двух часов при 37 градусов по Цельсию защищены от света.
В конце инкубации, мыть образцы с тремя пятиминутными моет в свежем PBS за стирку, прежде чем поместить каждый coverslip на отдельные стеклянные слайды микроскопа с образцами вверх. Затем аккуратно добавьте восемь микролитров соответствующей крепления среды в центр каждого крышки и используйте типсы, чтобы установить еще 10-миллиметровый крышку на каждый образец. Затем запечатать стороны каждого сэндвича с крышкой с четким лаком для ногтей, поместите образцы в папку картонной горки, и хранить слайды при четырех градусах по Цельсию.
Хотя вскрытие взрослых улитки мыши для поверхностных препаратов не просто, исследователи, новые для техники должны быть в состоянии узнать метод после практики с 10 до 15 ушей. Иммунолабелирование поверхностных препаратов необработанных 10-12-недельных мышей CBAJ с CTBP2 и GluA2 показывает, что как пресинаптические ленты, так и постсинаптические терминалы соответственно расположены под ядрами внутренних волосяных клеток и сопоставляются с указанием функциональных синапсов. Иммунолабелирование миозин 7А и противоустирование фаллоидином и ДАПИ показывает наличие сенсорных волосковых клеток, включая внешние волосковые клетки и внутренние волосковые клетки и их ядра.
Иммунолабелирование миозин 7А и противоустирование фаллоидином не показывает различий в иммунореактивности или однородности с использованием клея клеток и тканей или без него. Кроме того, сканирующая электронная микроскопия поверхностных препаратов от необработанных шести-восьминедельных черных 6 мышей C57 демонстрирует хорошо организованную V-образную стереоцилию наружных волосковых клеток в трех рядах образца. Не забудьте заполнить кохлеар с фиксаторным раствором мягко и медленно через круглые и овальные окна, пока раствор не вымывается из небольшого отверстия на вершине.
Прежде чем отделить область крючка от базального поворота, позаботьтесь о том, чтобы отрезать medialis от области крючка, чтобы облегчить удаление medialis.
