В природе, Cas9 является иммунным белком против вторжения вирусов, что эволюция предпочитает Cas9 с беспорядочной специфичностью, которая может расщеплять вирусную ДНК с спонтанными мутациями. Мы построили искусственную систему направленной эволюции, которая предпочитает оптимизированный вариант Cas9 с высокой специфичностью. И отрицательный, и положительный отбор работают одновременно в снайперской системе скрининга.
Варианты Cas9 с пониженной внецелейной активностью, также поддерживая целевую активность, могут быть проверены сразу. Мутации были введены в целом Cas9 последовательности случайным образом для производства библиотеки для проверки. И это сделало возможным поиск мутаций в неожиданных положениях.
В настоящее время многие исследователи в научных кругах и промышленности используют Y-тип Cas9 для терапевтических разработок. Тем не менее, специфика Y-типа Cas9 не оптимизирована, что может привести к плотно упакованы. У человека это означает неожиданные мутации в случайных генах, которые могут привести к серьезным побочным эффектам.
Есть много Cas9, как ферменты, которые разрабатываются в терапии. Наша техника может быть использована для улучшения специфичности других ДНК и нуклеидов, таких как Jipinger, Таиланд, и Cas9 также таких как CPF1. Создание библиотеки достаточно большой является ключом к увеличению возможностей, чтобы получить вариант с важной функцией.
Будьте уверены, чтобы получить высокую эффективность в этапе охлаждения, и использовать высокоэффективные компетентные клетки. Чтобы начать эту процедуру, добавьте одну нанограмму плазмиды CCDB и плазмиды SGRNA с двойным несоответствием в пятьдесят микролитров оттаяхих клеток BW25141 GOI. Аккуратно смешайте клетки с помощью пипетки и перенесите их в предварительно охлажденный, 0,1-сантиметровый кювет электропорации.
Преобразуй E-coli с двумя плазмидами с помощью электропорации. Сразу после завершения электропорации добавьте 250 микролитров среды SOC. Аккуратно пипетка раствор смешать клетки и средний, и передать смесь в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки.
Восстановить преобразованные клетки и инкубировать их при 32 градусах по Цельсию, с нежной тряски в течение одного часа. Продолжить подготовку Snyper скрининговых клеток, как указано в текстовом протоколе. Когда готовы выполнить Snyper скрининга, трансформировать Snyper скрининговых клеток с 100 нанограмм подготовленных Cas9 вариант плазмидов из каждой библиотеки с помощью процесса elctroporation, который был ранее описан.
Затем перенесите 250 микролитров клеток в свежую микроцентрифугную трубку на 1,5 миллилитров. Добавьте 250 пикограмм УВД к окончательной концентрации 10 нанограмм на миллилитр. Восстановить как УВД-содержащих и УВД свободных клеток, инкубируя их при 32 градусов по Цельсию в течение одного часа с нежной тряски.
Плита 25 микролитров восстановленных клеток без УВД на пластине Агара LB, содержащей хлорамфеникол и канамицин. Добавьте УВД в восстановленный УВД, содержащий клетки, до конечной концентрации 100 нанограмм на миллилитр на 245-миллиметровой агарной пластине LB. Немедленно пластины УВД-содержащих клеток на LB агар, содержащий пластины, содержащие хлорамфеникол, канамицин, и арабинозы.
Инкубировать все пластины на ночь при 32 градусах по Цельсию. На следующий день сфотографируй тарелки. Используя открытое программное обеспечение CFU, подсчитайте количество жизнеспособных колоний, убедившись, что количество колоний на не селективной пластине, по крайней мере, в десять раз больше, чем разнообразие библиотеки, чтобы охватить все варианты.
Потяните колонии, которые сохранились на селективных пластин из всех трех библиотек. Перенесите эти слитки в 250 миллилитров ЛБ среды, дополненные хлорамфениколом, и инкубировать на ночь при 42 градусах по Цельсию. Во-первых, загрузите программное обеспечение Cas OF finder, чтобы выбрать целевые сайты.
Выберите тип PAM, подходящий для конкретного типа Cas9 и генома цели. Заполните вкладку последовательностей запросов. Выберите номер несоответствия и нажмите кнопку отправки.
Через несколько секунд появятся целевые и нецелеумые сайты. Как правило, выбирайте нецелесопоставимые сайты с одним-тремя несоответствиями. Далее закажите CRRNA и Track RRNA oligos с последовательностями шаблонов и усильйте шаблон, изложенный в текстовом протоколе.
Проанализируйте два микролитера ДНК усиленного шаблона на 2%agarose гель, а затем очистить шаблон. Инкубировать реакционной смеси на ночь при 37 градусах по Цельсию. На следующий день добавьте 0,5 микролитров ДНК и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 15-30 минут, а затем очистить SGRNA.
Затем обработаем 10 микрограммов транскрибированной РНК в пробирке с 250 единицами щелочной фосфатазы кишечника в течение трех часов при 3 градусах по Цельсию, при наличии 100 единиц ингибитора РНКС, а затем очистим обработанную SGRNA. Во-первых, поддерживать HEK293 Т-клеток в DMEM дополняется 10%FBS и 1%антибиотиков при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа. Затем смешайте два микрограмма либо дикого типа, либо белка Snyper Cas9 с двумя микрограммами SGRNA и инкубировать при комнатной температуре в течение десяти минут, чтобы сделать комплексы RNP.
Трипсинизировать и считать клетки, а затем мыть их и подготовить их в буфер электропорации, как указано в текстовом протоколе. Электропорат RNP комплексы в клетки, используя один импульс 1300 вольт в течение 30 миллисекунд. Сразу после электропорации пластина клеток на 48-хорошо пластины заполнены 500 микролитров DMEM, дополняется 10%FBS и 1%антибиотиков.
Инкубировать при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом. Поддерживайте Т-клетки HEK293 в DMEM, дополненные 10%FBS и 1%антибиотиками при 37 градусах Цельсия с 5%carbon dioxide. За день до трансфекции, трипсинизировать и считать клетки.
При работе в масштабе 48-колодец, пластина 10 000 клеток на колодец и 250 микролитров полной среды роста. Используя липидный трансфектонный реагент, приготовьте 250 нанограммов плазмиды P3S Cas9 и 250 нанограммов SGRNA для трансфекции. Затем смешайте плазмиды в 25 микролитров без сыворотки MEM.
Разбавить один микролитер трансфектного реагента 25 микролитров без сыворотки MEM. Инкубировать эту смесь при комнатной температуре в течение пяти минут. Комбинат плазмидной смеси с смесью трансфекции реагентов и инкубировать в помещении в течение 20 минут, чтобы сформировать плазмидные комплексы липофектамина.
После этого добавьте 50 микролитров этой смеси непосредственно к каждой хорошо содержащей клетки. Аккуратно рок пластины вперед и назад, чтобы смешать. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе двуокиси углерода в течение 48 до 72 часов после трансфекции, прежде чем дать анализ на трансгенную экспрессию.
Изолировав ранее подготовленную геномную ДНК, создать библиотеки глубокого секвенирования путем усиления ПЦР GDNA с праймерами, нацеленными на цель и вне цели. Затем используйте индексные грунтовки для обозначения каждого образца. Используйте машину секвенирования следующего поколения, чтобы подвергать библиотеки пула парной последовательности конца.
После того, как экран Snyper выполняется, процент колоний выживания может быть рассчитан путем деления количества колоний на селективной пластине LB на количество колоний на не селективной пластине LB. Хотя этот процент, как правило, очень низок при исполнении с библиотеками SP Cas9, истинные положительные хиты могут быть обогащены, повторяя экран с выжившим бассейном. Представитель экрана Snyper показывает 100%выживаемость получается после третьего экрана.
Трансфекции с использованием РНП или плазмидной кодируемой Snyper Cas9 могут быть сделаны для различных целей, и в результате целевых и внецелесохозных мероприятий, измеряемых секвенированием целевых ампликонов. В большинстве целей Snyper Cas9 показывает тот же уровень целевой деятельности и более высокие коэффициенты специфичности по сравнению с диким типом. Для дальнейшего улучшения специфичности могут также использоваться сеченные SGRNAs.
Более высокая эффективность преобразования на первом этапе очистки очень важна, чтобы не потерять клонов с высокой специфичностью. Более поздние этапы скрининга повторяют меньшую эффективность преобразования, так как клоны уже обогащаются на первом этапе скрининга, и вероятность их потери меньше. Там будет более одного клона, который мы нашли на экране Snyper.
Деятельность этих клонов на цели и вне цели должна характеризоваться как можно большим количеством различных целей для выбора клонов с наилучшей производительностью. С помощью этого метода ученые могут улучшить специфичность ферментов, похожих на Cas9, без потери целевой активности. Кроме того, ученым не нужны какие-либо предварительные знания о структуре белка, чтобы сделать улучшения.
