В этом протоколе используется простой метод повышения надежности модели культуры 3D-клеток без использования какого-либо специального оборудования. Основным преимуществом этого метода является то, что мы можем провести повторяемый эксперимент 3D культуры, контролируя начальное состояние культуры в кубическом устройстве. После подготовки пяти на пять миллиметров поликарбонатной кубической рамы, поместите раму на предварительно охлаждено слайд и ледяной ящик и использовать пипетку, чтобы добавить 12 микролитров разогретой 1,5%agarose от верхней стороны кубической рамы до нижней поверхности.
Распространение агарозы, чтобы получить плоскую поверхность и позволить полимера вылечить. Используйте пинцет, чтобы сдвинуть раму к краю стекла и повернуть раму так, чтобы открытая сторона обращена вниз перед размещением рамы обратно на слайд. После заполнения следующих двух поверхностей рамы с более агарозы, как только что продемонстрировали, падение агарозы в контейнер с открытым лицом, чтобы сформировать стенку агарозы на четвертой и пятой сторон.
Для настройки начальной формы клеточного кластера ввеже вводится соответствующая внеклеточная матрица для клеточной культуры, представляющих интерес, в пространство культуры гибридного геля и устанавливается сфабрикованная микроформа на куб. Затем поместите куб в инкубатор двуокиси углерода в течение 25 минут при 37 градусах по Цельсию. Когда внеклеточная матрица вылечится, осторожно поднимите микро-форму, чтобы матрица не ухудшалась.
Карман в желаемой форме формы будет изготовлен во внеклеточной матрице. Для загрузки клеток концентрируется экспериментальная подвеска клетки после центрифугации в соответствующей экспериментальной среде клеточной культуры и впрыскивает клетки в карман в пределах внеклеточной матрицы. Поместите куб в инкубатор двуокиси углерода в течение 20 минут при 37 градусах по Цельсию, чтобы клетки упали во внеклеточный матричный карман, заполнив пространство, созданное микроформой.
В конце инкубации поместите куб в один колодец из 24 хорошо пластины и добавить 100 микролитров соответствующей среды культуры клеток в колодец. Ввесь дополнительную внеклеточную матрицу, чтобы закрыть карман и вернуть куб в инкубатор на 25 минут. Когда внеклеточная матрица вылечена падение примерно 10 микролитров 20 градусов по Цельсию агарозы на верхней поверхности куба, чтобы закрыть поверхность и вылечить падение в течение 10 до 20 минут при 37 градусов по Цельсию.
Затем накройте весь куб свежей средой для содействия осмотическому давлению для облегчения передачи питания клеткам в кубе. Для неинвазивного распознавания 3D-формы путем многонаправленного наблюдения поместите пластину на сцену микроскопа и получите изображения каждой стороны куба с помощью яркой полевой или фазовой контрастной микроскопии, используя пинцет для вращения кубиной службы, которая будет изображена между захватами. Для иммунофлуоресцентной визуализации путем многонаправленного наблюдения, сначала аспирировать супернатант из хорошо содержащего куб и исправить куб в 4%paraformaldehyde в течение 20 минут при комнатной температуре.
В конце фиксации, мыть куб два раза с PBS в течение 10 минут за стирку. Impermeabilize куб с 0,5%triton x-100 и PBS в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию. Затем, мыть куб три раза в PBS в течение 10 минут за стирку, прежде чем блокировать любые неспецифические связи с козьей сыворотки и иммунофторесценции буфера в течение 60 минут при комнатной температуре.
Затем испачкать клетки с соответствующими первичными антителами интерес в соответствии со стандартными протоколами окрашивания антител. Затем изображение всех шести сторон куба на лазерный или флуоресцентный микроскоп, как только что продемонстрировано. В этом репрезентативном эксперименте многонаправленная визуализация гибридных кубиков геля, культурных с нормальными человеческими бронхиальными эпителиальными клетками, демонстрирует генерацию начальной цилиндрической или призмообразной клеточной культуры путем фазового контраста и иммунофлуоресцентной визуализации культур.
Здесь иммуноокрашивание нормальных эпителиальных клеток человека изначально контролировалось до цилиндрической формы в гибридном гелевом кубе, после генерации бронхового дерева. Ветви демонстрируют перпендикулярно цилиндрической оси, о чем свидетельствует многомерная визуализация. Важно вводить высокую плотность клеток во внеклеточный матричный карман, так как низкая плотность клеток может привести к ухудшению качества клеток после инкубации.
Этот метод шаблона является повторяемым образованием 3D клеточного узора с количественным измерением с помощью многонаправленной визуализации для изучения механизма развития блюда.
