Этот протокол позволяет исследователям культуры колоний стволовых клеток на гидрогелях с полным контролем как за жесткость гидрогеля и геометрии колоний. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет исследователям культуры колоний стволовых клеток в условиях, которые лучше имитируют физиологическую среду, чем ткани культуры пластика. При выполнении этого протокола в первый раз, не забудьте создать несколько дополнительных каждого материала и использовать флуоресцентный лиганд, так что вы можете устранения неполадок и оптимизации на каждом шагу.
Этот метод включает в себя несколько шагов, которые включают точное позиционирование различных материалов. Гораздо проще понять письменные инструкции по этому протоколу, как только вы видели его выполнено. Чтобы начать эту процедуру, смешать PDMS базы с PDMS лечения агента на 10 к одному соотношению по весу и тщательно перемешать.
Дега эту смесь в децикатор в течение 30 до 60 минут или до тех пор, пока все пузырьки воздуха удаляются. Медленно и равномерно вылейте смесь PDMS на поверхность подготовленной пластины. Нажмите блюдо на рабочую поверхность, чтобы освободить любые пузырьки воздуха от поверхности пластины.
Выпекать PDMS при температуре 70 градусов по Цельсию в течение двух часов и дать ему остыть до комнатной температуры. Затем разрежьте PDMS примерно на 10 на 10 миллиметров квадратов, каждый из которых содержит функции для одного экспериментального состояния. Они будут называться марками для оставшейся части протокола.
После этого, смешать PDMS базы с PDMS лечения агента в соотношении восемь к одному по весу, и тщательно перемешать. Дега смесь в desiccator в течение 30 до 60 минут или до тех пор, пока все пузырьки воздуха удаляются. Затем медленно и равномерно вылейте PDMS в чистую 100-миллиметровую тарелку.
Нажмите блюдо на рабочей поверхности, чтобы освободить любые пузырьки воздуха. Выпекать PDMS при температуре 70 градусов по Цельсию в течение двух часов и дать ему остыть до комнатной температуры. Для каждой ранее сгенерированной марки, вырезать 15 на 15 миллиметров квадрат PDMS.
Они будут называться плоскими плитами для оставшейся части протокола. Инвертировать каждый генерируемый штамп на плоскую плиту PDMS таким образом, что функции на стенде в контакте с плоской плитой PDMS. Аккуратно нажмите на верхнюю часть штампа типсами, чтобы обеспечить даже контакт.
Далее поместите небольшую каплю УФ-излечимого полимера в верхний интерфейс каждой пары марок и плит. Полимер будет злой между ними поверхностным натяжением, которому помогает гравитация. Поместите небольшую каплю УФ-излечимого полимера по краям интерфейса штампа и плиты.
Это создает границу, которая будет держать лиганд решение. Затем аккуратно поместите штамп и пощечину пары в УФ-стерилизации окно. Используйте стерильные настройки питания STR и подвергать в течение 10 минут.
После этого удалите пары из окна УФ-стерилизации и используйте две пары типсов, чтобы аккуратно удалить штамп, удерживая плоскую плиту и трафарет, образовав из УФ-излечимого полимера. Используя типсы, аккуратно снимите трафарет и инвертировать его таким образом, чтобы поверхность, которая находится в контакте с плоской плитой PDMS, обращена вверх. Поместите перевернутые трафареты обратно в уф-стерилизацию.
Используйте стерильные настройки питания STR и подвергать в течение трех минут. Используя миппы, тщательно поместите каждый трафарет плоской стороной вниз на кислоту промывают крышки убедившись, что функции сосредоточены на крышке скольжения. Поместите небольшой кусочек лабораторной пленки поверх каждого трафарета.
Твердо и равномерно нажмите на трафарет, чтобы создать сильный контакт между трафаретом и крышкой. Поместите крышку скользит с трафаретами в блюдо. Поместите это блюдо в плазменный очиститель и нанесите высокой мощности плазмы в течение 30 секунд.
Затем, пипетка лиганд решение на поверхность каждого трафарета. Для трафаретов, сделанных из 10 на 10 миллиметров квадратных марок, нанесите 100 микролитров на трафарет. После этого, оберните блюдо, содержащее крышку скользит в лабораторной пленке и инкубировать при четырех градусах по Цельсию на ночь.
Во-первых, мыть крышки с трафаретом с помощью типсов, чтобы кратко погрузить его в блюдо, содержащее стерильные PBS. Погрузите крышку с трафаретом во второй этап PBS, чтобы вымыть его снова. Удалите трафарет с поверхности крышки, будучи осторожным, чтобы не сломать крышку.
Далее, кратко погрузить крышку в блюдо, содержащее ультрачистую воду, чтобы удалить соли из PBS моет. Коснитесь края крышки к деликатной задаче протрите, чтобы фитиль от избыточной воды. Высушите крышку под инертным газом, таким как азот.
Затем приготовьте полиакриламинидный раствор, чтобы получить желаемую эластичность гидрогеля. Для каждого узорчатого крышки, подготовить глутаральдехайд активированных нижней губы охватывает с пространством размещены на вершине. Pipette между 75 и 150 микролитров полиакриламидного раствора в центре каждого глутаральдехида активирована обложка.
Используя типсы, поместите узорчатый, чтобы покрыть скольжения на каждый глутаралде активированных охватывает скольжения с полиакриламида и спейсера таким образом, что узорчатый лиганд сталкивается с раствором полиакриламида. Аккуратно поместите каждый сэндвич с полиакриламинидом в держатель крышки с нитями, совместимыми с 15 миллилитровыми коническими нижними трубками. Винт 15 миллилитров конической нижней трубки в каждый держатель крышки провести полиакриламинид бутерброды на месте.
Центрифуга для полиакриламинида бутерброды в трубках в качели ведра в 200 раз G в течение 10 минут при комнатной температуре. Удалите трубки из центрифуги и поместите их в трубчатые стойки для поддержания ориентации в течение дополнительных 50 минут, чтобы обеспечить полную полимеризацию. Затем снимите бутерброды с трубок и погрузите их в PBS.
Оберните блюдо в лабораторную пленку и инкубировать при комнатной температуре в течение трех часов или при четырех градусах по Цельсию на ночь. После этого используйте скальпель и типсы, чтобы тщательно удалить шаблон, чтобы покрыть скользит и спейсер из полиакриламинида бутерброд, пока он остается погруженным в PBS. Поместите каждую крышку с узорчатым полиакриламинидом в держатель крышки.
Место прокладки на верхней части крышки скольжения и вокруг полиакриламида, где был расположен прокладка. Винт распилив 15 миллиметров конической нижней трубки в держатель крышки, образуя колодец с узорчатым полиакриламинидом в нижней части. Эти сборки вписываются в колодцы стандартной пластины 12 скважин для легкой обработки.
При выполнении этой техники используйте флуоресцентный лиганд для обеспечения того, чтобы желаемый узор создавался на поверхности скольжения стеклянной крышки и успешно передавались на поверхность полиакриламидного гидрогеля во время полимеризации. Конечной мерой успеха этого метода является способность к культуре гЕУ в желаемых геометриях на узорчатых гидрогелях. При культуре, изложенной в текстовом протоколе, гЕУ обычно распространяются для завершения узорчатой геометрии на 48-72 часа после полного удаления Y27632 из мультимедиа.
Культивирование колоний HESC в ограниченных геометриях на полиакриламидных гидрогелях позволяет измерять силы тяги, генерируемые клетками, с помощью тракциальной микроскопии. Эти измерения проводятся путем встраивания микросфер флуоресценции в гидрогель и визуализации положения этих бусин до и после посева гЕУ. Изображения позиций бисера могут быть использованы для создания карт смещения бисера, которые впоследствии могут быть использованы для расчета основных напряжений тяги.
В круговых колониях гЕУ крупнейшие тяговые напряжения находятся вблизи периферического края колоний, в то время как в центре колоний отображаются равномерно низкие тяговые напряжения. Несмотря на наблюдаемые неъединные распределения тяговых напряжений, гЕУ, культуризуемые как узорчатые круги в условиях технического обслуживания, отображают равномерное выражение маркера плюрипотенции 3/4 октября и молекулы клеточной адгезии E-кадерин. Этот метод позволит исследователям лучше моделировать человеческие эмбрионы с использованием эмбриональных стволовых клеток человека, что в конечном итоге приведет к важному пониманию того, как люди развиваются.
Эта процедура может быть адаптирована для любого применения, в котором исследователь стремится к культуре клеток в определенных геометриях на мягких гидрогелях. Эта процедура совместима с большинством биохимических кислот, что позволяет исследователям отвечать на вопросы о том, как такие вещи, как геометрия тканей и генерируемые клетками силы влияют на экспрессию белка и сигнализацию клеток. Многие исследователи в настоящее время используют эмбриональные стволовые клетки человека для моделирования раннего развития человека.
Этот метод позволит исследователям ответить на эти важные вопросы в условиях, которые лучше имитируют физиологическую среду.
