CMOD Pack позволяет моделировать клетки с очень высокой точностью и культивировать их в 2d или 3d. Это открывает возможности для изучения клеточно-клеточных взаимодействий и морфогенеза новых тканей-двигателей. Основным преимуществом этого метода является то, что его легко принять другим лабораториям, он не требует чистой комнаты, специализированного оборудования или пользовательских синтезированных реагентов.
Начните с того, что опустите небольшие капли положительного фоторезистента на альдегидный слайд, используя одноразовую пипетку. Вращайте затвор со скоростью 3000 об/мин в течение 30 секунд с помощью спин-кодировщика, затем поместите его на конфорку при 100 градусах Цельсия в течение 1,5 минут, чтобы сшивать фоторезистим. Снимите слайд с конфорки и поместите фотомаску с нужными функциями поверх слайда, взвесьте ее куском стекла и накройте всю установку непрозрачной коробкой.
Выставьте установку с помощью УФ-лампы в течение двух минут, разработайте слайд, погрузовав его в решение разработчика на три-пять минут, затем смойте лишний раствор разработчика водой, высушите его под потоком воздуха или азота. Наблюдайте за этим светом под микроскопом, чтобы подтвердить успех фотолитографии и храните его в темноте. Добавьте каплю 20 микромолярной аминовой модифицированной олигостостой области на каждую область слайда с рисунком фотографии и аккуратно распределите каплю по всей области, используя кончик пипетки, заботясь о том, чтобы не поцарапать слайд, испечь слайд в печи с температурой 65 градусов Цельсия, пока раствор ДНК полностью не высохнет, выполнить восстановительное аминирование, поместив запеченную горку и 15-сантиметровую чашку для культивирования клеток в вытяжку сверху шейкер.
Аккуратно смешайте 100 миллиграммов гидрида боро натрия в 40 миллилитрах PBS и добавьте его в блюдо. Затем включите шейкер на 15 минут. После реакции дважды промыть этот слайд 0,1% додецилсульфата натрия, чтобы удалить нереактированную ДНК.
Затем трижды промойте горку водой. Проведите этот горку под потоком азота или воздуха. Наконец, промойте его ацетоном, чтобы удалить оставшееся фоторезисто.
Подготовьте четырехмикролярный универсальный анкер и адаптер, как описано в рукописи текста, и подготовьте 20-микромолярный универсальный ко-анкерный раствор в PBS. Подготовьте клеточную суспензию путем повторного использования клеточной гранулы в одном миллилитрах ледяной холодной PBS или свободной от сыворотки среды и перенесите от одной до 3 миллионов клеток в 1,5-миллилитровую микроцентрифугу с трубкой центрифуги. Центрифуга в 160 раз G в течение четырех минут.
Повторно суспендируют полученную ячейку гранулы в 75 микролитрах ледяной PBS или сыворотки свободной среды и добавляют 75 микролитров подготовленного для микромоляра универсального анкерно-переходного раствора. Тщательно перемешайте и высиживайте в течение пяти минут на льду, добавьте в пробирку 15 микролитров универсального раствора для ко-анкеров и тщательно перемешайте, затем высиживайте образец в течение пяти минут на льду. Чтобы удалить лишние олиго из клеточной суспензии, добавьте в трубку один миллилитр ледяного холодного PBS или свободной от сыворотки среды и смешайте с пипеткой.
Гранулируют клетки центрифугированием в 160 раз G в течение четырех минут при четырех градусах Цельсия, затем отбрасывают супернатант. Повторите этот шаг еще два раза. Повторно суспендировать клетки в ледяной кол PBS или свободной среде сыворотки для создания клеточного плотного раствора не менее 25 миллионов клеток на миллилитр, слегка наклонить рисунок слайда, затем добавить 25 микролитров этой клеточной суспензии к входу каждой проточной ячейки.
Удалите раствор PBS и 1% BSA из выходного отверстия, позволив суспензии ячейки заполнить проточную ячейку PPM. Инкубировать на льду или при комнатной температуре в течение 30 секунд, аспирировать пять микролитров клеточной суспензии от выхода слайда и добавить ее обратно во входное отверстие. Повторите это 10 раз на проточную ячейку.
Аккуратно пипетку PBS или свободные от сыворотки среды впуск каждой проточной ячейки, чтобы вымыть лишние клетки и собрать клеточную суспензию с выхода. Повторяйте это два-четыре раза, пока на слайде не останутся лишние клетки. Для 3D культуры приготовьте раствор-предшественник гидрогеля, содержащий 2% ДНК, и добавьте 50 микролитров его на вход каждой проточной ячейки.
Аспирировать лишнюю жидкость из выхода, загоняя раствор гидрогеля в проточную ячейку. Инкубируют слайд при температуре 37 градусов цельсия в течение 30-45 минут, чтобы гидрогели могли зацепиться и расщеплить адгезию на основе ДНК между клетками и поверхностью. Добавьте 50 микролитров предшественника гидрогеля в скважину с двухкамерным затвором или шестиямещатной пластиной.
Пипетка 10 микролитров PBS по обе стороны от каждой проточной ячейки. Распределите его по всей длине проточной ячейки с помощью бритвенного лезвия или найдите точечный пинцет и осторожно поднимите стороны проточных ячеек так, чтобы PBS устремился под гидрогель. Используя лезвие бритвы, переместите протольную ячейку к краю слайда, переверните затвор и оттолкните проточную ячейку от слайда так, чтобы она приземлился поверх бритвенного лезвия.
Соберите проточную ячейку с лезвия бритвы с помощью изогнутых щипцов. Инвертировать клетки потока так, чтобы клетки были на дне и поместить их сверху на каплю раствора предшественника гидрогеля. Инкубировать в течение, по меньшей мере, 30 минут, чтобы гидрогель, содержащий клетки паттерна, мог связываться с подложкой гидрогеля, что приводит к полному встраиваю клеток паттерна.
Снимите проточную ячейку и полностью погрузите ее в мочную мочку. Осторожно подталкивайте проточную ячейку с помощью изогнутых щипцов, пока она не выскочет и не всплывет в среде, а затем выбросьте ее. Количественная оценка адгезии пятна ДНК к CMO меченым клеткам, которая увеличивается.
в качестве функции концентрации ОКУ представляется как среднее и стандартное отклонение от трех экспериментов. Паттерны ДНК показаны в пурпурном и прилипшие клетки CMO меченые в синяке при разных концентрациях CMO. Здесь показано сравнение Гувеков, меченных ОКУ, и Хувеков, меченных ЖИО, придерживающихся линейного паттерна ДНК.
Одиночные MDCK паттерн VSC MOD pack, и переведенные в гель мэтр смогли размножаться и поляризоваться после пяти дней культивации. Многослойные многоклеточные агрегаты были созданы путем чередования слоев клеток, помеченных дополнительными ОКУ. Множественные уникальные клеточные популяции могут быть склеено вместе с высокой точностью и без перекрестного загрязнения.
При попытке этого протокола очень важно иметь плотную клеточную суспензию при добавлении клеток к слайду, чтобы максимизировать возможности для клеток прилипать к пятнам ДНК.
