Влияние микроокружающих факторов на поведение клеток часто изучается с использованием упрощенных платформ in vitro, которые выделяют отдельные сигналы. Наш подход создает субстраты клеточных культур, которые сочетают в себе несколько из этих сигналов. Этот подход очень универсален и позволяет проводить систематическое исследование с использованием широкого спектра материалов клеточной культуры, контактных ориентиров, клеточных показаний и белков.
Процедура будет продемонстрирована двумя кандидатами PSE из нашей лаборатории. CAS VAN DER PUTTEN и MIRKO D'URSO Во-первых, создают отрицательную стеклянную форму с использованием фемтосекундной лазерной техники прямого права, содержащей все интересующие особенности. Затем аккуратно поместите негативную стеклянную форму на дно чашки Петри и вылейте полидиметилсилоксан предварительно полимер поверх отрицательной стеклянной формы, чтобы полностью покрыть ее.
Поместите эту чашку Петри в вакуумный осушитель и запустите вакуумный насос. Как только вакуум будет достигнут, подождите 5 минут, чтобы удалить все пузырьки, присутствующие на границе раздела между поверхностью формы и полидиметилсилоксановым полимером. Отверните предварительный полимер PDMS на ночь в духовке при температуре 65 градусов Цельсия.
После отверждения используйте шпатель, чтобы приподнять края PDMS. Удалите недавно отвержденный положительный чип PDMS из отрицательной стеклянной формы, и если положительный чип PDMS имеет тенденцию прилипать к отрицательной стеклянной форме, добавьте этанол или воду к краям отпечатка во время подъема. Затем поместите положительный чип полидиметилсилоксана в осушитель рядом с небольшим флаконом с капелькой силанизационного агента и оставьте чип под вакуумом на ночь.
Налейте предварительный полимер PDMS в отрицательную форму PDMS для получения нескольких чипов клеточной культуры толщиной 5 миллиметров. Далее удалите пузырьки с помощью осушителя и отверждайте в течение трех часов при 65 градусах Цельсия. Используйте лезвие бритвы, чтобы разрезать стружку до окончательного размера и хранить стружку при комнатной температуре Для пассивации подложки с помощью пинцета поместите чип в корзину плазмы Ашера.
Затем используйте кислородную плазму для активации гидроксильных групп на поверхности чипа и выпускайте камеру зольности с использованием азота. Выньте чипс из корзины и поместите его в небольшой контейнер с полидиметилсилоксаном. Теперь используйте пастерную пипетку, чтобы добавить 500 микролитров поли-L-лизина в верхнюю часть чипа, чтобы полностью погрузить поверхность в раствор и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.
Затем удалите 450 микролитров поли-L-лизина из чипа клеточной культуры пипеткой. Затем промываем поверхность чипа трисом 500 микролитров 0,1 молярного буфера HEPES. Поддерживайте конечное качество рисунка, оставляя небольшой объем жидкости на чипе полидиметилсилоксана, чтобы предотвратить высыхание образца.
Непосредственно перед использованием приготовьте 500 микролитров по 50 миллиграммов на миллилитр метоксиполиэтиленгликозиального раствора цианамида валерата в буфере 0,1 молярной кучи на чип клеточной культуры и инкубируйте образец в нем в течение 60 минут. С помощью микропипетки удалите 450 микролитров метоксиполиэтиленгликозиального раствора цианамидалного валерата. Вымойте поверхность стружки пять раз с помощью PBS путем пипетки внутрь и наружу.
Чтобы удалить все несвязанные mPEG-SVA. Поместите стеклянный слайд с флуоресцентным маркером в оптический контур микроскопа. Переключитесь в флуоресцентный режим на микроскопе и тщательно сфокусируйте изображение primo, гарантируя, что и логотип, и текст находятся в фокусе.
Нажмите далее, чтобы увидеть данные калибровки и шаблон, чтобы завершить процедуру калибровки. Запишите Z-местоположение этапа при калибровке и используйте это местоположение в качестве ссылки позже в протоколе. После извлечения калибровочного слайда со сцены поместите стеклянный слайд, содержащий каплю инициатора фотографии, на сцену и поместите подложку культуры клеток PDMS вверх ногами, в каплю инициатора фотографии.
Убедитесь, что 3D-элементы на поверхности подложки клеточной культуры обращены к стеклянному слайду и полностью погружены в инициатор фотографии, чтобы обеспечить правильное моделирование. Сосредоточьтесь на верхней или нижней части выпуклых или вогнутых структур соответственно и сосредоточьтесь на области чипа в правильном месте, как описано в рукописи. Отрегулируйте параметры рисунка в соответствии с функцией и выберите дозу 1000 миллиджоулей на миллилитр.
Нажмите кнопку воспроизведения в правой нижней части экрана, чтобы начать создание шаблона. После завершения наблюдайте за рисунком, отображаемым зеленым цветом. Используя микропипетку, добавьте два миллилитра PBS во флакон с 20 микрограммами родамина, меченого фибронектином, чтобы получить концентрацию 10 микрограммов на миллилитр.
Пипетку осторожно, чтобы избежать сгустков белка и защитить от света. Используя микропипетку, добавьте от 200 до 500 микролитров белкового раствора в чип клеточной культуры. Отрегулируйте время инкубации и температуру в зависимости от выбранного белка и обязательно накройте образец.
Удалите белковый раствор и промойте чип пять раз 500 микролитрами стерильного PBS. Убедитесь, что PBS поднимается и опускается несколько раз над всеми соответствующими функциями чипа клеточной культуры, чтобы удалить любой несвязанный белок. После того, как клеточная суспензия подготовлена, удалите PBS и добавьте 1 миллилитр клеточной суспензии в чип.
Затем высиживают его в течение 60 минут при 37 градусах Цельсия. Проверьте адгезию клеток на образце клеточной культуры чипа под ярким полевым микроскопом. Ищите удлиненные морфологии клеток в случае линейных паттернов.
И если клетки начали прилипать за пределами узорчатой области, удалите их, пипетируя среду вверх и вниз непосредственно над клетками на подложке. После окрашивания поместите окрашенный образец вверх ногами в каплю PBS на стеклянном слайде. Затем, в зависимости от требуемого уровня детализации, сделайте Z стеки с подходящей целью и Z-интервалом для обеспечения правильного получения изображения.
Создайте 3D-рендеринг стека Z с помощью программного обеспечения для 3D-рендеринга. Вогнутая яма была построена с использованием светового индуцированного молекулярного поглощения белков и визуализирована проекция максимальной интенсивности и ортогональный вид. Профиль интенсивности показал высокое разрешение паттерна резкие переходы между узорчатыми и неструктурированными областями и постоянную интенсивность белка.
Моделирование с использованием метода одной фокальной плоскости, а также двух и трех фокальных плоскостей показало идеальное выравнивание узоров поверх объектов. Вогнутые полуцилиндры, выпуклые полуцилиндры, седловая поверхность и PID были выстроены с использованием линий или концентрических кругов различной ширины. Воздействие внутри скелета кератоцитов человека окрашивается с помощью фолидена и визуализируется.
Дермальные фибробласты культивировали на узорчатом вогнутом полуцилиндре и визуализировали. Клетки ощущали и прилипали к субстрату мультикубковой клеточной культуры и оставались жизнеспособными с течением времени, как визуализируется F-актином, винкулином и ядрами. Также клетки образовывали очаговые спайки преимущественно на фибронектиновых линиях.
Кожные фибробласты человека, культивируемые на узорчатом вогнутом цилиндре в присутствии родамина фибронектина, прилипали к многокиевому субстрату и демонстрировали реакцию выравнивания в соответствии с контактным ориентиром. Реакция выравнивания и жизнеспособность клеток поддерживаются на протяжении всего периода культивирования. Самое главное при выполнении этого протокола – не допустить высыхания поверхности чипа клеточной культуры.
Использование различных материалов подложки, белковых покрытий и типов клеток может потребовать дополнительной оптимизации. Предоставление нескольких сигналов окружающей среды в 3D может открыть новые возможности для управления клеточной организацией в сложных инженерных тканях.
