Микроскопия DIC превосходит темное поле при визуализации плазмонных наночастиц в сложных средах. Тем не менее, DIC также требует больших знаний и навыков для получения воспроизводимых результатов. Микроскопия DIC обеспечивает как высокое боковое разрешение, так и неглубокую глубину резкости.
Обе эти черты чрезвычайно важны при мониторинге наночастиц в клетках или в сложных средах. Для начала используйте ручку для того, чтобы поместить неглубокую и короткую царапину на центр каждой стеклянной крышки, а затем очистить стекло, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Далее используйте микропипюту, чтобы удалить 100 микролитров 05-миллиграммового на миллилитрового наночастицы золота из своего первоначального контейнера для хранения и выбросить раствор в 1,5-миллилитровую центрифугу.
Центрифуга образца в течение 10 минут при 6000 раз тяжести. После завершения, удалить супернатант с micropipette, чтобы избавиться от избыточного сурфактанта из наночастиц раствора. Затем добавьте 100 микролитров ультра-чистой воды в центрифугу.
Кратко вихрь образца разбить гранулы, а затем sonicate его в течение 20 минут сразу после этого, чтобы полностью повторно наночастицы агрегатов. Используя микропипюту, dropcast шесть микролитров раствора наночастиц на очищенные и поцарапаемые стеклянные крышки. Затем аккуратно переверните крышку и поместите его поверх второго большего куска микроскопа стекла.
Падение должно быстро равномерно распределиться между двумя кусками стекла. Позаботьтесь, чтобы избежать получения пузырьков воздуха в ловушке между двумя кусками стекла. Используйте узкую линию лака для ногтей, чтобы запечатать края крышки, чтобы предотвратить испарение жидкости.
Поместите образец на стадию микроскопа и выровняете цель и конденсатор микроскопа. Отрегулируйте фокус, чтобы найти фокусную плоскость с образцом на нем и найти царапины знак, созданный ранее. Сосредоточьтесь на нем и отладить фокус, пока наночастицы приходят в поле зрения.
Чтобы определить точное размещение конденсатор, используйте метод освещения Kohler, начиная с 20x цели, а затем переходя к высоким увеличениям, таким как 80 или 100x. Далее выберите область, интересную в образце для визуализации. Центр региона в поле зрения камеры, и настроить фокус по мере необходимости.
Если микроскоп имеет дизайн де Senarmont, начните с поляризатора, установленного вблизи максимального фонового вымирания и постепенно поверните поляризатор в сторону уменьшения фонового вымирания. Интенсивность фона будет постепенно увеличиваться. Идеальная настройка достигается, когда наночастицы достигают наибольшей разницы интенсивности по сравнению со средним местным фоном.
Для плазмонических наночастиц наибольший контраст обычно достигается при относительно темном фоне при максимальном фоновом вымирании или вблизи него. Выключите освещение помещения, чтобы предотвратить взаимодействие с процессом с рассеянным освещением. Поставь на место 10-нанометровый фильтр полной ширины при полу максимуме диапазона-прохода с его центральной длиной волны, расположенной совместно с основной локализованной волновой волной резонанса плазмона, чтобы просмотреть область интереса.
Затем отрегулируйте интенсивность лампы или время экспозиции до тех пор, пока фоновый уровень не будет на уровне от 5%до 40% от максимального уровня емкости камеры. Никакие объекты в пределах области интереса не должны проявлять интенсивность сигнала, превышающую 90% от максимального уровня интенсивности камеры. Изображение образца с серией диапазон-проходных фильтров, каждый из которых имеет полную ширину на половину максимума 10 нанометров, и что в целом позволяют изображения по всей длине волны диапазона интереса.
Убедитесь, что интенсивность фона на изображениях остается в пределах 5% друг от друга, регулируя время экспозиции, а не мощность лампы. После переключения фильтров переориентация образца перед захватом изображений. Сохраните изображения как нестехаженные файлы TIFF и/или в родном формате файла программного обеспечения, чтобы сохранить всю соответствующую информацию.
Чтобы начать анализ, откройте изображение с ImageJ. Используйте прямоугольник инструмент, чтобы нарисовать прямоугольник вокруг основной области интереса. Затем на панели инструментов выберите изображение, перейдите к масштабированию и выберите выделение.
Окно изображения увеличит выбранную область. Далее выберите изображение, перейдите на настройку и выберите яркость/контрастность. Чтобы улучшить представление о области выборки, отрегулируйте минимальный, максимальный, яркость и контрастность изображения.
Эти корректировки не меняют научных данных, они лишь обеспечивают лучшую видимость региона выборки. Теперь используйте прямоугольник инструмент снова и нарисовать коробку вокруг первой наночастицы, которые будут измерены. Коробка должна быть лишь немного больше воздушного диска наночастицы.
После выбора перейдите к анализу и выбору измерения. Появляется новое окно, которое сообщает о минимальной, максимальной и означаемой интенсивности для пикселей, расположенных внутри выбранного окна. Сохраняя первоначальный размер коробки, перетащите коробку в область, непосредственно прилегающую к частице, где фоновый контраст относительно овеян, и никаких частиц или загрязняющих веществ нет.
Используйте инструмент измерения снова, чтобы определить средняя интенсивность для фоновой области. Повторите этот процесс для каждой частицы во всех изображениях серии. Затем экспортировать данные в электронную таблицу для расчета контрастности или интенсивности каждой частицы на всех длинах волн и углах.
Введите следующее уравнение для расчета контрастности каждой частицы. Наконец, на график спектрального профиля в данном положении наночастиц путем построения данных с длиной волны вдоль X-оси и контрастности или интенсивности вдоль Y-оси. Чтобы определить оптимальную настройку изображения, эти золотые наносферы были изображены в нескольких поляризаторных настройках.
При нулевом градусе частицы появляются в основном белыми с темной полосой, бегущей по их животу. Это свидетельствует о перекрестной поляризации образцов наносферы. Когда поляризатор вращается под разными углами, частицы отбрасывают темные тени в один угол.
Однако значения контраста частиц резко меняются. Для этого образца оптимальная настройка изображения с поляризатором сдвиг на 10 градусов. Здесь длина волны построена на фоне контраста золотых наносфер.
Каждая точка данных представляет в среднем 20 наносфер для каждого диаметра частицы. Пиковый контраст для каждой частицы немного смещается в зависимости от ее размера. Интенсивность и вращение еще более важны с анисотропных форм, таких как этот золотой нанород.
Здесь длина волны построена против интенсивности в двух различных настройках поляризатора. В каждом случае интенсивность яркой стороны намного сильнее, чем у темной стороны. Профиль интенсивности одного золотого нанорода на локализованной поверхности плазмонные резонансные длины волны во время вращения сцены показывают большую разницу интенсивности между темными и яркими сторонами, как образец вращается через 180 градусов.
Образец изображения является чрезвычайно важным. Это требует как усердия, так и терпения со стороны микроскопа. Если вы проводите эксперимент, который требует переосмысления образца в течение нескольких дней, то такие ориентиры, как царапины, имеют решающее значение для перемещения вашего региона интересов.
Микроскопия DIC растет интерес исследователей, которые изучают наночастицы, особенно в динамичной и клеточной среде. Потому что DIC предлагает оптимальное пространственное разрешение, особенно в сложных средах отбора проб.
