Наш протокол позволяет исследователям генерировать иерархические сети сосудов в полностью спроектированном и имплантируемом лоскуте, что проложило путь для новых исследований поведения кровеносных сосудов в рамках интеграции in vivo. Этот метод сочетал в себе универсальность двух технологий 3D-печати для создания и сборки сосудов на микро- и мезомасштабе, которые могут быть непосредственно анастомозированы с сосудами-хозяевами с помощью микрохирургии. Полностью спроектированные васкуляризированные лоскуты могут использоваться для лечения больших дефектов тканей, а также для обеспечения платформы для изучения развития тканей и интеграции.
Предложенные способы могут быть расширены для изучения инкорпорации тканеспецифических клеток, а также для оценки использования различных биочернил и вспомогательных материалов. Начните с заполнения формы BVOH 30 микролитрами раствора полимера. Центрифугируйте форму в 100 раз г в течение 2 минут и доливайте форму еще 20 микролитрами полимерного раствора для обеспечения полного наполнения.
Заморозьте заполненные формы при минус 80 градусах Цельсия в течение не менее 30 минут, чтобы весь полимерный раствор замерз. Удалите растворитель из форм, лиофилизируя их на ночь. Чтобы удалить жертвенный материал плесени, перенесите формы после процесса сублимационной сушки на 5-литровую деионизированную водяную баню при мягком перемешивании.
Замените воду в ванне, когда она помутнеет. Когда все BVOH растворится, высушите каркасы на воздухе и храните их в вакуумной камере до использования. Перенесите приблизительно 4 миллилитра подготовленного, уплотненного опорного материала в каждую скважину 12-луночной пластины с помощью пипетки с положительным смещением.
Постучите пластиной колодца по твердой поверхности, чтобы заставить опорный материал равномерно распределяться в колодце. Приготовьте суспензию, содержащую 2 миллиона HAMEC-ZsGreen и 6 миллионов стволовых клеток пульпы зубов в 10 миллилитрах среды эндотелиальных клеток. Центрифугируют клеточную суспензию в 200 раз г в течение 4 минут для получения клеточной гранулы, затем аспирируют надосадочную среду и повторно суспендируют клеточную гранулу в 1 миллилитре биочернила rhCollMA для получения биочернила с общей клеточной концентрацией 8 миллионов клеток на 1 миллилитр биочернила.
Установите иглу внутреннего диаметра 0,22 миллиметра на 3-миллилитровый янтарный печатный картридж и поместите картридж в 50-миллилитровую коническую трубку. Переложите 1 миллилитр клеточно-биочернилой смеси на картридж, заполнив его сверху с помощью пипетки с положительным смещением для уменьшения пузырьков. Установите картридж в соответствующий инструмент на биопринтере.
Набросайте 2D-рисунок 4-миллиметрового квадрата, содержащего в центре круглый канал диаметром 2 миллиметра. Выдавите эскиз на 4 миллиметра, чтобы получить 4-миллиметровый куб с центральным каналом. Экспортируйте этот объект в виде STL-файла.
Импортируйте 12-луночный шаблон STL пластины на вкладку твердотельного моделирования в программном обеспечении для нарезки биопринтера и поместите его в назначенную область виртуального печатного ложа. Импортируйте STL-файл фигуры куба на вкладку моделирования твердого тела в программном обеспечении для нарезки биопринтера. Установите флажок Использовать внешний срез, а затем настройте срез в разделе свойств объекта.
Во всплывающем окне выберите прямолинейный узор для шаблона заливки и введите плотность заливки 30%, нажмите кнопку Принять. Нажмите на куб и переместите его с помощью мыши, чтобы поместить копию формы куба в каждый нужный виртуальный колодец. Нажмите кнопку «Добавить материал» на вкладке «Материалы» программного обеспечения для нарезки биопринтера, чтобы создать новые настройки материала для биочернила rhCollMA.
Выберите параметры материала для печати. Для давления введите 2 psi, а для скорости 20 миллиметров в секунду в соответствующих полях. Присвойте значениям ширины и высоты строки 0,24 мм, а значению ускорения — 400 миллиметров в квадратную секунду.
На вкладке «Моделирование твердого тела» щелкните объект куба, а затем щелкните материал rhCollMA из раздела материала, чтобы назначить его форме куба. На вкладке биосборки нажмите кнопку Отправить задание на печать, чтобы отправить задание печати на биопринтер. Загрузите картридж, загруженный ячеистым биочернилом, в 3-миллилитровый пневматический дозирующий инструмент биопринтера на основе экструзии 3D.
Нажмите кнопку Cool под вкладкой Control Heating или Cooling на экране интерфейса биопринтера, чтобы установить температуру печатного слоя на 4 градуса Цельсия. Загрузите пластину с опорной ванной на кровать принтера. На вкладке Печать на экране интерфейса биопринтера щелкните задание печати, затем нажмите кнопку Пуск, а затем GO, чтобы начать задание печати.
После печати подвергните пластину скважины 405-нанометровому источнику света с интенсивностью 3 милливатта на квадратный сантиметр в течение 30 секунд, чтобы инициировать сшивание биочернила rhCollMA. После сшивки инкубируйте пластину скважины при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение не менее 20 минут, пока вся опорная ванна не расплавится. Аккуратно аспирируйте сжиженную опорную ванну и замените ее средой эндотелиальных клеток.
Инкубируйте конструкции при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Сразу после удаления поддерживающего материала из биопечатной микрососудистой сети поместите сосудистый каркас PLLA:PLGA с фибронектиновым покрытием рядом с биопечатной структурой. Вставьте сосудистый каркас в основной канал биопечатной структуры.
Инкубируйте собранные конструкции при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение двух дней. Готовят клеточную суспензию tdTomato-экспрессирующих микрососудистых эндотелиальных клеток человека в концентрации 10 миллионов клеток на миллилитр. Поместите 20-микролитровую каплю этой клеточной суспензии на гидрофобную поверхность.
Аккуратно поместите сосудистые каркасы поверх капли так, чтобы просвет каркаса на одном конце соприкасался с каплей клетки. Аспирируйте каплю с противоположного конца каркаса, заполняя его просвет клеточной суспензией. Поместите сидячий каркас в микроцентрифужную трубку и поместите его в ротатор внутри увлажненного инкубатора на 60 минут.
Наконец, переложите каркас в 12-луночную пластину и добавьте 2 миллилитра эндотелиальной клеточной среды. Вид сбоку репрезентативного инженерного лоскута, изображенного через четыре дня после эндотелиальной выстилки сосудистого каркаса, показан здесь. Биопечатное микроциркуляторное русло показано зеленым цветом, в то время как эндотелиальная подкладка показана красным.
Репрезентативное изображение показывает анастомозы между биопечатной сосудистой системой и эндотелиальной оболочкой. Иммуноокрашивание гладкой мускулатуры актина, ядер и эндотелиальных клеток после семи дней инкубации показано здесь. Репрезентативное изображение отображает завершенные анастомозы инженерного лоскута с бедренной артерией крысы до снятия зажима и после снятия зажима.
Этот метод может быть использован для изучения созревания и интеграции 3D-печатной сосудистой системы in vivo и мониторинга перфузии имплантата в задней конечности для установления потенциала и безопасности его использования для лечения дефектов тканей.
