Это в Виво фагоцитоз анализ позволяет исследователям проводить генетические экраны и генома всей ассоциации исследований для выявления новых генов, которые регулируют фагоцитоз во взрослых кровяных телец. Этот эксперимент является количественным, простым в проведении и может быть применен к скринингу живых животных на факторы-хозяина, влияющие на распознавание патогенов, поглощение и очистку. После потянув тонкостенные стеклянные капилляры с иглой шкив, использовать микрометр, чтобы держать иглу под микроскопом, и использовать номер пять, тонкой точки, пинцет из нержавеющей стали, чтобы сломать кончик на 100-микрометровый диаметр кончика.
Чтобы измерить объем жидкости, которая будет введена в каждую муху, загрузите капиллярную иглу стерильной 5%пищевой краситель в PBS, и изгнать жидкость на каплю минерального масла на 0,01-миллиметровый микрометр стадии. Выделите 10 микролитров по 1,6 миллиграмма на миллилитровые частицы на небольшой квадрат Парафильма и потяните жидкость в иглу. Намонтировать иглу в сопло инжектора, и линия анестезированной мух вдоль их назначенной области на лету площадку, брюшной стороне вверх, с головами, ориентированными на передней части площадки.
Поместите флаконы в соответствующих областях на скамейке, и вводить мух в верхнем углу живота с пятью, 100-миллисекундные насосы жидкости, чтобы доставить около 10 нанолитров частиц в общей сложности. Перенесите каждую муху в соответствующий флакон по мере введения, увежев время на флаконе. Затем загрузите новую иглу раствором 0.4%Trypan Blue и установите пневматический инжектор на закрытый, чтобы постоянный поток воздуха выталкивал жидкость из иглы.
Через 30 минут после первоначальной инъекции, вводить каждую муху живота с Trypan Blue до тех пор, пока животы полны и разтянуты. Гора мух на микроскоп слайды с электрической лентой, брюшной стороны вниз, толкая крылья в сторону мухи, чтобы обеспечить их на ленту. Затем осторожно нажмите головой в ленту, чтобы убедиться, что муха не будет двигаться.
Сразу же после того, как все мухи были обеспечены, изображение насекомых, по одному, в 25 или 32 раза увеличение на перевернутый флуоресценции микроскоп прилагается к цифровой камере и компьютеру, сосредоточив внимание на спинной сосуд каждой мухи с помощью компьютерного программного обеспечения для цифровой камеры. Затем завехать время экспозиции и увеличение между экспериментами. Для количественной оценки флуоресценции откройте соответствующую программу анализа изображений и откройте одно изображение.
Для измерения интенсивности флуоресценции спинного сосуда нарисуйте полигон вокруг спинного сосуда и выберите меру для записи интенсивности флуоресценции внутри полигона. Чтобы определить интенсивность фоновых флуоресценций, скопировать первый полигон, и переместить его в область, прилегающую к спинной сосуд каждой мухи. Затем выберите Меру и замитьте интенсивность флуоресценции фоновой области.
Для нормализации флуоресценции спинного сосуда фоновой флуоресценцией, после измерения интенсивности флуоресценции остальных мух, разделите флуоресценцию спинного сосуда на фоновую флуоресценцию и вычислите среднюю нормализованную интенсивность флуоресценции спинного сосуда всех мух в одном штамме. После установки брюшной стороны вниз на кусок электрической ленты, первые два сегмента живота, где спинной сосуд находится, хорошо видны. Основные источники экспериментальной ошибки возникают на этапах инъекций и визуализации процедуры.
Использование одной и той же иглы для введения нескольких мух может привести к тому, что она засоряется тканью мухи или частицами. Мухи, которые не получают достаточно флуоресценции Трипан Голубой ярко по всей их брюшной полости, что может уменьшить отношение спинного сосуда к фоновой флуоресценции, тем самым уменьшая истинное соотношение интенсивности флуоресценции животного. Мухи следует фотографировать, обездвижив углекислым газом, так как активно движущиеся мухи производят размытые изображения, которые не поддаются количественной оценке.
Мутант линии из коллекции Зукер этил метансульфонат обработанных мух не в состоянии фагоцитозных грамотрицательных и грамположительных бактерий и отображает почти нет спинного сосуда флуоресценции в анализе фагоцитоза in vivo, в паре с изогенным фоном штамма Цукер и другой общий штамм лабораторного контроля. Следите за временем и порядком, в котором мухи вводятся для обеспечения того, чтобы мухи находятся на сопоставимых стадиях распознавания патогенов и поглощения при изображении. Молекулярные механизмы, лежащие в основе фагоцитных дефектов, могут быть определены путем изучения одиночных гемоцитов с конфокальные микроскопии или после флуоресценции активированной сортировки клеток или магнитной изоляции бисера взрослых гемоцитов.
