Dieser in vivo Phagozytose-Assay ermöglicht es Forschern, genetische Screens und genomweite Assoziationsstudien durchzuführen, um neuartige Gene zu identifizieren, die die Phagozytose in adulten Blutzellen regulieren. Dieses Experiment ist quantitativ, einfach durchzuführen und kann auf das Screening von lebenden Tieren auf Wirtsfaktoren angewendet werden, die die Erkennung, Aufnahme und Clearance von Krankheitserregern beeinflussen. Nach dem Ziehen dünnwandigen Glaskapillaren mit einem Nadelzieher, verwenden Sie ein Mikrometer, um die Nadel unter dem Mikroskop zu halten, und verwenden Sie Nummer fünf, Feinpunkt, Edelstahl Pinzette, um die Spitze auf einen 100-Mikrometer-Spitzendurchmesser zu brechen.
Um das Flüssigkeitsvolumen zu messen, das in jede Fliege injiziert wird, laden Sie eine Kapillarnadel mit steriler 5%Lebensmittelfärbung in PBS und vertreiben Sie die Flüssigkeit auf einen Tropfen Mineralöl auf einem 0,01-Millimeter-Mikrometer. 10 Mikroliter 1,6 Milligramm pro Milliliter Partikel auf ein kleines Quadrat Parafilm geben und die Flüssigkeit in die Nadel ziehen. Montieren Sie die Nadel in die Injektordüse und säumen Sie die anästhesierten Fliegen entlang ihres vorgesehenen Bereichs auf dem Fliegenpolster, ventrale Seite nach oben, mit den Köpfen, die nach vorne ausgerichtet sind.
Legen Sie die Fläschchen in den entsprechenden Bereichen auf die Bank, und injizieren Sie die Fliegen an der oberen Ecke des Bauches mit fünf, 100-Millisekunden-Pumpen flüssigkeitsmenge, um insgesamt etwa 10 Nanoliter Partikel zu liefern. Übertragen Sie jede Fliege in die entsprechende Durchstechflasche, wie sie injiziert wird, unter Notierung der Zeit auf der Durchstechflasche. Als nächstes laden Sie eine neue Nadel mit 0,4%Trypan Blue Lösung, und stellen Sie den pneumatischen Injektor auf gated, um einen konstanten Luftstrom zu ermöglichen, um die Flüssigkeit aus der Nadel zu drücken.
30 Minuten nach der ersten Injektion, injizieren Sie jeden Fliegenbauch mit Trypan Blue, bis die Bauchmuskeln voll und distended sind. Montieren Sie die Fliegen auf Mikroskop-Dias mit elektrischem Klebeband, ventrale Seite nach unten, schieben Sie die Flügel zur Seite der Fliege, um sie auf dem Band zu sichern. Dann drücken Sie vorsichtig den Kopf in das Band, um sicherzustellen, dass sich die Fliege nicht bewegt.
Unmittelbar nachdem alle Fliegen gesichert sind, stellen Sie die Insekten, eine nach der anderen, bei einer 25- oder 32-fachen Vergrößerung auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop, das an einer Digitalkamera und einem Computer befestigt ist, ab und konzentrieren sich dabei auf das Dorsalgefäß jeder Fliege mit der Computersoftware für die Digitalkamera. Zeichnen Sie dann die Belichtungszeit und die Vergrößerung zwischen den Experimenten auf. Um die Fluoreszenz zu quantifizieren, öffnen Sie ein geeignetes bildgebendes Analyseprogramm, und öffnen Sie ein Bild.
Um die Fluoreszenzintensität des dorsalen Gefäßes zu messen, zeichnen Sie ein Polygon um das dorsale Gefäß, und wählen Sie Messen aus, um die Fluoreszenzintensität innerhalb des Polygons aufzuzeichnen. Um die Hintergrundfluoreszenzintensität zu bestimmen, kopieren Sie das erste Polygon und verschieben Sie es in einen Bereich neben dem dorsalen Gefäß jeder Fliege. Wählen Sie dann Messen aus, und zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität des Hintergrundbereichs auf.
Um die Fluoreszenz des Dorsalgefäßes durch die Hintergrundfluoreszenz zu normalisieren, nachdem die Fluoreszenzintensitäten der übrigen Fliegen gemessen wurden, teilen Sie die dorsale Gefäßfluoreszenz durch die Hintergrundfluoreszenz auf und berechnen Die durchschnittliche normalisierte fluoreszenzierte Fluoreszenzintensität aller Fliegen in einem Stamm. Nach der Montage der ventralen Seite nach unten auf einem Stück elektrischem Klebeband sind die ersten beiden Segmente des Bauches, in denen sich das Rückengefäß befindet, deutlich sichtbar. Bei den Injektions- und Bildgebungsschritten des Verfahrens entstehen wichtige Quellen für experimentelle Fehler.
Die Verwendung der gleichen Nadel, um mehrere Fliegen zu injizieren, kann dazu führen, dass es mit Fliegengewebe oder Partikeln verstopft wird. Fliegen, die nicht genügend Trypan Blue Fluoreszenz hell über ihren gesamten Bauch erhalten, was das Verhältnis des Rückengefäßes zur Hintergrundfluoreszenz reduzieren kann, wodurch das wahre Fluoreszenzintensitätsverhältnis des Tieres verringert wird. Fliegen sollten fotografiert werden, während sie durch Kohlendioxid immobilisiert werden, da aktiv bewegte Fliegen verschwommene Bilder erzeugen, die nicht quantifiziert werden können.
Eine mutierte Linie aus der Zuker-Sammlung von Ethylmethansulfonat-behandelten Fliegen ist nicht in der Lage, gramnegative und grampositive Bakterien zu phagozytose und zeigt fast keine dorsale Gefäßfluoreszenz im in vivo phagozytose-Assay, gepaart mit dem isogenen Hintergrund Zuker-Stamm und einem weiteren gemeinsamen Laborkontrollstamm. Verfolgen Sie die Zeit und die Reihenfolge, in der Fliegen injiziert werden, um sicherzustellen, dass sich Fliegen in vergleichbaren Stadien der Erkennung und Aufnahme von Krankheitserregern befinden, wenn sie abgebildet werden. Die molekularen Mechanismen, die phagozytischen Defekten zugrunde liegen, können durch Untersuchung einzelner Hämozyten mit konfokaler Mikroskopie oder nach fluoreszenzaktivierter Zellsortierung oder durch magnetische Perlenisolierung von adulten Hämoszyten bestimmt werden.
