Этот протокол решает трудности и проблемы с микроинъекцией личинки, описывая точный метод, который позволит использовать личинку Drosophila melanogaster в качестве модели для различных иммунных и молекулярных исследований. Это простая инъекционная техника, которая представляет собой эффективный, экономичный и быстрый метод многократной доставки различных веществ единообразным образом, что позволяет получать последовательные и надежные результаты. Начните с выбора личинок третьей стадии и мыть их раствором Рингера в небольшой чашке Петри.
Поместите фильтровальную бумагу в чашку Петри и смочите ее 5 мл раствора Рингера. Затем поместите личинки на фильтровальную бумагу. Подготовьте капилляры, используя 3,5-дюймовые стеклянные капиллярные трубки в съемнике микропипетки.
Откройте стеклянный капилляр с помощью прямых зазубренных среднеточечных щипцов. Наполните открытый капилляр минеральным маслом с помощью пластикового одноразового шприца. Затем выбросьте масло из капиллярной трубки с помощью нанолитрового инжектора.
Наполните капилляр нужным бактериальным препаратом для инъекций. Переложите обезболенные личинки на фильтровальную бумагу, смоченную раствором Рингера. С помощью щипцов оказывайте сильное давление на спинную сторону заднего конца личинок, где заметны дыхальца трахеи.
Затем вставьте иглу горизонтально, к заднему концу личинок, и введите бактериальные запасы. Удалите щипцы, чтобы избежать разлива гемолимфы или кишечника. Затем извлеките иглу, предварительно вставленную в личинки.
Заражайте 20 личинок для каждого экспериментального состояния. С помощью кисти аккуратно перенесите введенные личинки в отдельную влажную фильтровальную бумагу. Добавьте решение Рингера по мере необходимости, чтобы предотвратить высыхание.
Инкубировать чашку Петри в инкубаторе при 25 C.Личинки Drosophila melanogaster, инфицированные Photorhabdus asymbiotica, демонстрировали 57%-ную выживаемость в течение 24 часов после инъекции, в то время как личинки, введенные кишечной палочкой, показали 85% выживаемость в тот же момент времени. Важность этого метода заключается в том, что игла держится примерно параллельно личинке. Давление, прилагаемое для удержания личинки, очень мало, что снижает вероятность утечки гемолимфы, смертельной травмы или неадекватной доставки желаемого вещества.
Эта техника может быть усовершенствована с практикой.
