この生体内食細胞化アッセイは、研究者が成人血液細胞の貪食を調節する新しい遺伝子を同定するために、遺伝的スクリーンおよびゲノムワイド関連研究を行うことを可能にする。この実験は、定量的に実行しやすく、病原体の認識、取り込み、およびクリアランスに影響を与える宿主因子の生きた動物のスクリーニングに適用することができる。薄壁のガラス毛細血管を針の引き手で引っ張った後、マイクロメーターを使用して針を顕微鏡の下に保持し、5番の細かい点、ステンレス鋼のピンセットを使用して先端を100マイクロメートルの先端直径に割ります。
各フライに注入される液体の量を測定するには、PBSで無菌5%の食品着色剤を持つ毛細血管針をロードし、0.01ミリメートルの段階マイクロメートルで鉱物油の滴に液体を排出します。1ミリリットル当たり10マイクロリットルをパラフィルムの小さな正方形に分配し、液体を針に引き込みます。注射器ノズルに針を取り付け、麻酔付きハエをフライパッドの指定された領域に沿って並べ、腹側を上に、ヘッドはパッドの前面に向けます。
バイアルをベンチの対応する領域に置き、腹部の上部にハエを5個、100ミリ秒の液体ポンプで注入し、合計で約10ナノリットルの粒子を送達します。各フライを適切なバイアルに移し、バイアルの時間に基づいて注入します。次に、0.4%のTrypan Blue溶液で新しい針をロードし、空気インジェクターをゲートに設定して、一定の空気の流れが針から液体を押し出すことを可能にします。
最初の注射の30分後、腹部がいっぱいになるまでトリパンブルーで各フライ腹部を注入し、膨張させます。ハエを電気テープで顕微鏡スライドに取り付け、腹側を下に下ろし、翼をハエの側面に押し付けてテープに固定します。その後、テープに頭をそっと押し込み、フライが動かないようにします。
すべてのハエが確保された直後に、デジタルカメラとコンピュータに取り付けられた反転蛍光顕微鏡上で、デジタルカメラ用のコンピュータソフトウェアを使用して各ハエの後部血管に焦点を当てて、昆虫を一度に1回ずつ画像化します。次に、実験間の露光時間と倍率を記録する。蛍光を定量するには、適切なイメージング解析プログラムを開き、1つの画像を開きます。
後部血管の蛍光強度を測定するには、後部血管の周囲に多角形を描き、測定を選択して多角形内部の蛍光強度を記録します。背景蛍光強度を決定するには、最初のポリゴンをコピーし、各フライの裏側血管に隣接する領域に移動します。次に、[測定]を選択し、背景領域の蛍光強度を記録します。
バックグラウンド蛍光による背部血管蛍光を正規化するために、残りのハエの蛍光強度を測定した後、背部血管をバックグラウンド蛍光で除算し、全てのハエの平均正常化された背振り強度を1株で算出する。電気テープの上に腹側を取り付けた後、後部容器が置かれている腹部の最初の2つのセグメントははっきりと見える。実験エラーの主な原因は、手順の注入およびイメージングステップで発生します。
同じ針を使用して複数のハエを注入すると、フライ組織や粒子で詰まる可能性があります。十分なトリパンブルー蛍光を十分に受け取らないハエは、腹部全体を通して明るく、後部血管の背景蛍光に対する比率を減少させ、動物の真の蛍光強度比を低下させることができる。ハエは二酸化炭素で固定化しながら撮影する必要があります, 積極的に動くハエは、定量化することができないぼやけた画像を生成します.
エチルメタンスルホン酸ハエのZukerコレクションからの変異線は、グラム陰性およびグラム陽性細菌を貪食することができず、生体内ファゴサイトーシスアッセイにおいてほとんど背後血管蛍光を示さない。ハエが画像化されたときに病原体認識と取り込みの同等の段階にあることを確認するために、ハエが注入される時間と順序を追跡します。食細胞性欠損の根底にある分子メカニズムは、共焦点顕微鏡による単血球の研究、または蛍光活性化細胞選別後、または成体血球の磁気ビーズ単離によって決定することができる。
