Радиолабелирование углерода-11 позволяет использовать небольшие соединения для позитронно-эмиссионной томографии или ПЭТ без изменения молекулы. Это необходимо для изучения уровней экспрессии рецепторов. Преимущество радиозабелки углерода-11 заключается в том, что мы можем использовать ПЭТ для непосредственной оценки привязки SNAP кинетики к рецептору гормона концентрации меланина в режиме реального времени.
SNAP как меланин-концентрации гормона рецептора антагонист будет способствовать лучшему пониманию этого рецептора и его связь с метаболическими условиями, как ожирение и диабет. Транспортеры Efflux, выраженные при геммоумперате, могут значительно затруднить использование радиофармацевтических средств для визуализации экспрессии центральных рецепторов. Поэтому важно оценить следы in vitro.
Автоматизированный радиосинтез SNAP широко применим к радиозабеле с низким молекулярным весом соединений с легко поддаются оценке метиловой группы. После создания эта процедура может быть адаптирована для других соединений. Помощь в демонстрации будут старшие аспиранты Сара Пфафф и Тереза Балбер.
Для начала синтеза углерода-11 SNAP создала чистый модуль синтеза углерода-11 с соответствующими реагентами и материалами. Запустите процесс синтеза SNAP на модуле компьютера, который начнется с проверки системы и кондиционирования. Примерно за 30-40 минут до того, как модуль будет готов к поставке C-11, выберите цель двуокиси углерода C-11 на циклотроне и запустите луч на 65 микроамперах.
Как только модуль будет готов к доставке, закройте внутреннее окно и внешнюю дверь. Подтвердите, что ловушка CO2 остыла по крайней мере до 40 градусов по Цельсию и что метановая ловушка начала охлаждаться. После того, как циклотрон произвел около 120 гигабеккерелей C-11 CO2 нажмите OK в программном обеспечении модуля, чтобы открыть путь от цели через ловушку CO2.
На циклотроне компьютер начинает доставлять c-11 CO2 к модулю. Мониторинг передачи активности на компьютере модуля и убедитесь, что он переходит к сокращению СО2 до метана через три минуты. Мониторинг процесса, как в результате метана смывается в ловушку метана и преобразуется в йодид метила путем циркуляции через йодную печь.
В конце последовательности преобразования подождите, как побочные продукты смываются из ловушки метил йодида, чтобы исчерпать, а затем подтвердить, что реактор готов к получению деятельности, нажав OK. Мониторинг системы, как метил йодид высвобождается из ловушки, промытый через метил трифлат печь и в ловушке в реакторе. Когда активность на плато реактора подтвердит, что захват завершен. Подождите, пока реакция смеси реагирует на 75 градусов по Цельсию в течение трех минут.
Затем следите за системой, как реакция смесь охлаждается ниже 35 градусов по Цельсию и затухают с 1,5 миллилитров воды. Мониторинг системы, как реакция смесь загружается в цикл впрыска HPLC и вводится в полу-подготовительной колонке HPLC. Следите за следами УФ- и гамма-детекторов по мере продолжения хроматографии.
Когда пик продукта начинает появляться вручную начать сбор продукта в круглой нижней колбе коллекции в модуле. Вручную конец сбора, когда гамма-сигнал падает ниже около 400 рассчитывает в секунду. Следите за уровнем жидкости в круглой нижней колбе, когда продукт загружается на твердый картридж для извлечения фазы под давлением гелия.
После того, как колба пуста и жидкость прошла через картридж SPE, нажмите OK, чтобы начать мыть продукты, захваченные на картридже. Затем контролировать активность в флаконе сбора продуктов, как продукт сначала eluted из картриджа во флакон, а затем разбавленной 0,9% солевой раствор. Следите за тем, как раствор продукта передается в флакон продукта через стерильный фильтр под давлением гелия.
Когда передача будет завершена, закройте выходной клапан продукта. Когда радиотракер прибывает в продукт флакон мера абсолютной радиоактивной урожайности. Затем используйте шприц со свинцом для передачи 100 микролитров трассировщика в небольшой флакон для контроля качества.
Принесите образец контроля качества в защищенную рабочую зону контроля качества. Нарисуйте 40 микролитров образца КК в газо-плотный шприц, загрузите его в подготовленный прибор HPLC, оснащенный аналитической колонкой, и ввилите продукт. Выполняем другие измерения контроля качества во время запуска HPLC.
После того, как запуск HPLC закончил интегрировать все пики в хроматограмме от детектора радиоактивности, чтобы определить, является ли snap радиохимической чистоты больше, чем 95%Интеграция пиков в УФ хроматограммы для определения химической чистоты продукта. Используйте область под пиком УФ-продукта для расчета конкретной активности. После того, как продукт был подтвержден для удовлетворения требований к использованию релиз радио трассировщик в режиме реального времени кинетического эксперимента лаборатории.
По крайней мере за 30 минут до начала эксперимента промыть подготовленный дикий тип или трансфицированные клетки с DPBS и добавить два миллилитров сыворотки свободной среды роста. Для блокирования трансфицированных клеток добавьте 0,98 микролитров 20,4 миллимолярный раствор racemic verapamil гидрохлорид в диметилсульфоксиде. Инкубировать клетки на косой плоскости в течение 30 минут.
Затем включите инструмент анализа в режиме реального времени и связанный с ним компьютер. Откройте программное обеспечение управления и выберите одну цель. Установите количество позиций до двух, время обнаружения до трех секунд, время задержки обнаружения до двух секунд и имя первой фазы до базовой линии.
Вставьте блюдо культуры клетки в наклонную поддержку прибора с полюсом клетки на нижней стороне. Убедитесь, что клеточный полюс покрыт средой клеточной культуры. Начните 10-минутное фоновое измерение и установите имя файла и путь.
Установите шкалу времени до минут и сбор нуклида до углерода-11. Настройте график, чтобы показать фоновые, целевые и фоновые вычитаемые целевые данные. После того, как радио трассировщик был доставлен и одобрен для использования, возьмите небольшой образец для анализа.
Рассчитайте необходимый объем раствора радиотейзера и подготовьте пипетки. В программном обеспечении инструмента приостановить запуск и ждать, пока блюдо вращения, чтобы остановить. Откройте крышку устройства, поверните опору на 90 градусов влево, добавьте радиотейлер с подготовленным пипеткой и верните устройство в исходное положение.
Закройте крышку устройства и немедленно возобновите эксперимент. Пусть эксперимент продлится 20 минут, прежде чем закончить его. Обработать и проанализировать данные для оценки поглощения SNAP в клетках.
Теперь процедура может быть повторена для DMSO-обработанных клеток культуры блюдо и дикий тип клеточной линии. Кинетические анализы в режиме реального времени проводились с помощью не-PGP, выражаюющих клетки дикого типа, PGP-экспрессирующие клетки, предварительно заблокированные с верапамилем в качестве ингибитора PGP, и разблокированные клетки PGP. Существенной разницы между необработавленными клетками и клетками, обработанными транспортным средством, не наблюдалось.
Углерод-11 SNAP быстро накапливается в клетках дикого типа, в то время как в клетках, выражаюющих PGP, накопления не наблюдалось. Предварительная блокировка транспортера PGP efflux с верапамилем привела к накоплению SNAP в клетках PGP, сопоставимых с клетками дикого типа. В сочетании с кинетическими измерениями в реальном времени эта настройка позволяет получить широкое представление о фармакокинетии соединений низкой молекулярной массы и поэтому имеет большое значение для доклинического развития радиофармацевтических препаратов.
Сроки и организация являются основными ингредиентами для успешного радиосинтеза углерода-11 с последующими кинетическими экспериментами в режиме реального времени, так как период полусейна углерода-11 составляет всего 20 минут. Благодаря короткому периоду полуготовности углерода-11 многие части этой процедуры выполняются одновременно. Важно, чтобы все участники понимали масштабы и сроки своей роли.
Безопасность продукции и радиационная защита являются ключевыми для подготовки радиофармацевтических препаратов. Все эксперименты должны следовать как низко как разумно достижимый или принцип ALARA, чтобы ограничить радиационное облучение оператора.
