Этот протокол описывает, как лучше всего функционализировать кантилеверы AFM с помощью одиночных Т-клеток и твердых частиц. Эти советы могут быть использованы для зондирования одной пары дендритных взаимодействий клеток-Т-клеток и для мониторинга клеточных реакций непостоянного размера, соответственно. Основным преимуществом этой техники является то, что он использует биосовместимый клей для одноклеточной функционализации кантилеверов.
Этот клей является инертным для эукариотических клеток, тем самым сохраняя Т-клетки в их базовой стадии активации. Эти методы дают представление об активации иммунных клеток и сложных межклеточных событиях, таких как формирование иммунной синапзы. Методы также могут быть распространены на другие системы, связанные с взаимодействием клеток-клеток или поверхности клетки.
Для кого-то, что является новым для этой техники, важно, чтобы убедиться, что Т-клетки находятся в хорошем состоянии до использования, и что они предварительно обработаются с IL-2 на ночь. Кроме того, при использовании биосовместимого клея, двигаться быстро, чтобы защитить его от ненужного окисления. Чтобы начать эту процедуру, подготовьте одиночные Т-клетки для микроскопии, следуя вместе в текстовом протоколе.
Затем приготовьте стеклянные крышки, посеянные клетками DC2.4, и инкубировать клетки на ночь во влажной камере при 37 градусах Цельсия и 5%CO2. Чистые мягкие, безоголовесные кантилеверы с низкой пружинной константой с использованием терапии пираньей, очистки плазмы или очистки УФ-озона. Затем смонтировать очищенный кантилевер к сканирующей голове AFM.
Затем приготовьте чистую пробную камеру и заполните ее чистой водой. Калибруйте кантилевер в водном растворе, сначала запуская кривую силы на стеклянном субстрате, чтобы получить чувствительность кантилевера. Затем завехайте спектр теплового шума, чтобы извлечь пружинную константу.
При правильной калибровке кантилевера удалите головку сканирования AFM из раствора. Вымойте установленный кантилевер с несколькими каплями чистого этанола, и держать кантилевер сухой на сканирующей головке. Разогреть корпус среды живых клеток до 37 градусов по Цельсию с 5%CO2.
Затем смонтировать стеклянную крышку, посеянную клетками DC2.4, к сборке камеры образца и немедленно добавить в камеру 600 микролитров Medium B. Поместите завершенную сборку на этап образца AFM. Добавьте в образец камеры ИЛ-2 инкубированные CD4-положительные Т-клетки.
Подождите, пока целевые Т-клетки полностью оседают на дне крышки, а затем привести клетки в поле зрения под микроскопом. Теперь добавьте двухмиберную каплю биосовместимого клея на конец установленного кантилевера с пипеткой. После того, как биосовместимый клей был применен к кантилеверу, последующие шаги должны быть завершены как можно скорее, чтобы максимизировать адгезию.
Быстро поместите сканирующей головки на стадии образца, погружая клей покрытием кантилевер в раствор. Переместите стадию образца до тех пор, пока ячейка здоровья T не будет расположена под кончиком кантилевера. Затем тонко отрегулируйте свое положение, перемещая сканирующей головки.
Далее опустите кантилевер вручную. Начните с 50-микрон шаг размер, а затем уменьшить до 10, пять, и два и, наконец, 0,5 микрона постепенно, о чем свидетельствует резкость кантилевера изображения. Теперь удерживайте положение степперных двигателей и отрегулируйте позиционирование сканирующей головки, чтобы лучше выровнять кончик кантилевера и ячейку.
Продолжайте до тех пор, пока твердый контакт не будет обозначен небольшим смещением положения лазера, что соответствует типичной силе от 0,5 до 1,5 нанонютонов. После 30 секунд контакта, отказаться от кантилевера. Если ячейка перемещается с кантилевером, вложение было успешным.
Если нет, повторите шаг адгезии до трех раз, прежде чем перейти на новый кантилевер. Распоить прикрепленную Т-клетку над ячейкой DC2.4, перемещая этап образца и сканирующей головки. После настройки надлежащих параметров запустите силовую спектроскопию над образцом.
Для нового раунда зондирования, смонтировать новый, чистый кантилевер. Откалибровать его в чистой воде, а затем вернуться к Т-клеток дендритической пары клеток и повторить сканирование. Намонтировать очищенные стеклянные крышки к сборке камеры образца.
На левую сторону крышки добавьте каплю шарикового раствора, разбавленного этанолом и соединяемого шестимиронового диаметра полистирола. Как только растворитель испаряется, проверьте расстояние между бусинами с помощью ярко-полевого микроскопа, оснащенного 20-й целью. Убедитесь, что отдельные бусы хорошо разделены.
Затем окуните наконечник микропипета или зубочистку в хорошо смешанный эпоксидный клей и перенесите небольшое количество клея в три отдельных пятна с последовательными нежными касаниями с правой стороны, но близко к центру крышки, как показано здесь. Затем смонтировать очищенный, бесхитный кантилевер к сканирующей головке AFM и откалибровать его в воздухе с чистой поверхностью, чтобы получить пружинную константу. Затем, положение кантилевера опрокинуть левую границу последнего эпоксидного клея месте, и медленно довести кантилевер близко к клею с помощью небольших размеров шага на степпер двигателей.
После того, как контакт был сделан с клеем, быстро тянуть кантилевер боковой, перемещая AFM сканирования головы назад. Удалите излишки клея, потирая его от стекла, оставляя только небольшое количество клея в самом конце кончика. Теперь перемести кончик кантилевера поверх хорошо изолированной шарика.
Подойди к одной шарик медленно, и сделать твердый контакт с ним в диапазоне от двух до пяти наноньютонов в течение примерно 10 секунд. При контакте используйте регулировку тонкой наконечника, чтобы распоставить шарик в самом конце кончика. Оттягивать наконечник в конце контакта.
Если шарик исчезает из исходной фокусной плоскости, произошло успешное событие адгезии. Наконец, демонтировать бисером модифицированных кантилевер тщательно, и хранить его в кантилевер поле на ночь для эпоксидной смолы, чтобы полностью вылечить. Вот типичные кривые расстояния силы от связывающего взаимодействия между одной Т-клеткой и одной дендритической ячейкой в течение одного цикла отвода подходов.
Светло-красная кривая является кривой расширения, а темно-красная - кривой опрокидывания. Минимальное значение кривой дает меру максимальной силы адгезии между Т-клеткой и дендритической ячейкой, а область под кривой представляет собой работу, необходимую для их разъединения. Резкие и шаг за шагом события разрыва могут быть истолкованы как мембранные тросы, вытягиваемые из поверхности клетки из-за сильного связывания в интерфейсе ячейки-клетки, а затем дискретно ломающиеся под непрерывным вытягиванием.
Здесь обычное связывание Т-клеток с дендритными клетками показано серым цветом, а регулятивная привязка Т-клеток к дендритным клеткам показана синим цветом. Силы адгезии между обычной Т-клеткой и регулятивной Т-клеткой распознают пептидные антигены, представленные клетками, преподносятыми антигенами, в то время как регуляторные Т-клетки являются супрессора Т-клеток, которые выключают обычный Т-клеточный иммунитет к концу иммунной реакции. Эта схема флуоресцентно помечены, фагоцитатический RAW264.7 ячейки показывает клетки подходили с одной голой, шесть микрон диаметром, полистирол шарик.
После привлечения шарика, мембрана PIP2 сортируется в месте контакта, рядом с b, который затем вызывает мембранный набор моэзина, что приводит к фагоцитическому событию. В дополнение к описанной здесь процедуре, одноклеточная спектроскопия силы AFM может быть использована вместе с флуоресцентной визуализацией для изучения активации иммунных клеток в режиме реального времени на одноклеточном уровне. Комбинированные методы флуоресценции, этот метод позволяет для решения более сложных клеточных процессов в режиме реального времени, таких как формирование иммунного синапса между дендритной клетки и Т-клеток пары.
