Этот протокол может быть использован для проверки массивных лентивирусных или ретровирусных библиотек анализа для выявления новых регуляторов транскрипционных факторов в раковых клетках. Основными преимуществами этой техники является то, что она является быстрой, средней пропускной способностью и недорогой, и что она использует оборудование и реагенты, широко доступные для большинства исследователей. Чтобы расширить и очистить каждый лентивирусный вектор в библиотеке, сначала добавьте 1,3 миллилитров бульона Luria, дополненного 100 микрограммами на миллилитр ампициллина в каждую колодец 96-ну глубокой пластины.
Прививать каждую колодец двумя микролитерами глицеролов для ночной инкубации при 37 градусах По Цельсию и 225 оборотов в минуту. На следующий день, передача каждой культуры бактерий в отдельных 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки для центрифугации. Очистить каждый вектор соответствующим набором бактериального минипрепа в соответствии с инструкциями производителя.
Для каждого вектора в подготовленной библиотеке, семена один колодец 24-хорошо пластины с 1 раз от 10 до пятого 293FT клеток и инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение 24 часов. Для подготовки трансфектной смеси, которая будет создана для каждого вектора в библиотеке, сначала утелите каждый лентивирусный вектор до конечной концентрации 50 нанограмм на микролитер с нуклеазной водой. Перенесите пять микролитров каждого разбавления в отдельные скважины из 96-хорошо ПЦР пластины.
Сделайте трансфекцию супер микс, смешивая 1,25 микролитера раз х трансфекции реагент один с 23,75 микролитров раз х предварительно раз нагревается трансфекции буфера. Инкубировать трансфекции супер смесь при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем добавьте 125 нанограмм х psPAX2 и 125 нанограмм раз х VSVG в супер смесь с нежной пипетки.
Немедленно aliquot супер смешивание в каждую трубку полосы PCR и используйте многоканальный пипетку для передачи 25 микролитров смеси в каждую колодец разбавленного вирусного вектора. После 20-минутной инкубации при комнатной температуре используйте многоканальный пипетку для переноса 30 микролитров каждой трансфекции смеси из каждой хорошо в соответствующий колодец из 293FT-клеток в ранее подготовленной 24-хорошой пластине. Инкубировать клетки в течение 24 часов, прежде чем заменить средний в каждой хорошо с 500 микролитров свежей полной среды роста еще 24-часовой инкубации в инкубаторе клеточной культуры.
На следующий день используйте многоканальный пипетку для сбора вирусного супернатанта из каждой скважины и aliquot 220 микролитров каждого супернатанта в две скважины в новой пластине 96 скважин для создания массивируемой вирусной супернатантной пластины. Чтобы подготовить клетки A375 к инфекции, семя один раз от 10 до пятой клетки в 24-хорошо пластины в 0,5 миллилитров полного роста среды на колодец для каждого вирусного вектора в библиотеке. Включите дополнительный колодец, который не будет заражен, чтобы служить в качестве контроля для выбора наркотиков.
После 24-часовой инкубации в инкубаторе клеточной культуры, оттепель замороженных массивных лентивирусных супернатант установлен на комнатную температуру, прежде чем заменить рост среды из каждой хорошо подготовленной пластины клеточной культуры с 200 микролитров роста среды дополняется 20 микрограмм на миллилитр полибрения. Используя многоканальный пипетку, перенесите 200 микролитров вирусного супернатанта с каждой 96 хорошо в каждую колодец 24-хорошо пластины. Верните клетки в инкубатор клеточной культуры на 24-48 часов.
В конце инкубации замените среду в каждой из них 500 микролитров среды роста, дополненных пуромицином, и верните клетки в инкубатор клеточной культуры еще на 48 часов. После 48-часового отбора пуромицина, сортировать клетки на три или четыре группы, так что все скважины в одной группе имеют аналогичную плотность клеток и добавить 200 микролитров трипсина-ЭДТА к одному представителю хорошо из каждой группы для пятиминутной инкубации при 37 градусах по Цельсию. После того, как клетки отделились, нейтрализовать трипсина с 400 микролитров среднего роста дополняется пуромицин и подсчитать количество клеток из каждого трипсинизированного хорошо.
Разбавить каждую часть клетки подвески в два раза от 10 до пятой клетки на миллилитр концентрации с ростом среды дополняется пуромицином и семян 500 микролитров клеток из каждого хорошо в том же положении хорошо в новой 24-хорошо пластины. После использования подсчетов от каждого представителя хорошо оценить количество клеток в каждой оставшейся хорошо в каждой группе, добавить соответствующий объем трипсина-ЭДТА к каждой хорошо для достижения один раз от 10 до шестой клетки на миллилитр концентрации. Во время трипсинизации используйте многоканальный пипетку, чтобы добавить 400 микролитров среды роста, дополненных пуромицином, к соответствующим скважинам в новой пластине из 24 скважин.
После того, как клетки отсоединились, аккуратно смешайте содержимое каждой колодец и перенесите 100 микролитров каждой клеточной подвески на соответствующую хорошо в новой 24-хорошой пластине. Затем верните клетки в инкубатор культуры клеток в течение 24 часов. Для того чтобы transfect клетки с двойным-luciferase репортер строит, подготовляют смесь разбавления transfection как показано в таблице.
Для подготовки репортер разбавления смеси, смешать объемы каждого реагента умножается на общее количество трансфекций плюс несколько дополнительных томов. Затем смешайте смесь разбавления трансфекции смесью разбавления репортера и инкубировать полученный раствор при комнатной температуре в течение 15 минут, чтобы произвести смесь трансфекции. Во время инкубации, промыть каждый колодец пластины клеточной культуры с 250 микролитров PBS и добавить 447 микролитров свежей полной среды роста к каждой хорошо.
Затем используйте многоканальный пипетку для распределения 53 микролитров трансфектной смеси для каждого колодец пластины клеточной культуры. Поместите пластину при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе в течение 24 часов. Для измерения активности люциферазы разбавьте 5X пассивный буфер лиза из набора активности люциферазы при разбавлении разбавляемой водой и оттаив необходимые объемы буфера реагента А и реагента B из комплекта.
Когда реагенты будут готовы, замените супернатант в каждом хорошо с 75 микролитров пассивного буфера лиза и инкубировать пластину в течение 30 минут при комнатной температуре с редким встряхивания. Во время инкубации разбавьте субстрат 50X реагент B из комплекта в концентрацию от одного до 50 с размороженным буфером реагента B. В конце инкубации добавьте 30 микролитров пассивного буфера лиза в четыре пустые контрольные скважины и перенесите 30 микролитров лизата из каждой скважины в дублирующие скважины 96-ну плоской нижней белой анализа пластины.
Когда все лизат был поцаращен, используйте многоканальный пипетку, чтобы добавить 50 микролитров реагента А к каждой хорошо и прочитать сигнал светлячка люциферазы с считывателем пластины. Затем используйте многоканарновую пипетку, чтобы добавить 50 микролитров реагента B к каждому колодец и прочитать сигнал Renilla luciferase с считывателем пластин. Как и ожидалось, YAP2SA увеличивает активность светлячков люциферазы, но не активность рениллы люциферазы по сравнению с вектором контроля.
В отличие от этого, YAP2SA S94A не увеличивает активность светлячков люциферазы. Важно отметить, что YAP2SA не изменяет активность минимальной конструкции промоутера, в котором отсутствуют обязательные элементы MCAT TEAD. В клетках, трансфицированных с yaP-ТАЗ-TEAD репортер построить, тандем YAP и ТАЗ короткие шпильки значительно снизили уровень светлячка люциферазы, но контроль короткий шпильки не ориентации контроля нет.
В отличие от этого, в клетках, трансфицированных с минимальной конструкцией репортера, ЯП-ТАЗ короткие шпильки РНК не существенно изменить уровень светлячка люциферазы. Сигнал Renilla в каждой хорошо также не существенно изменены короткой шпильки не-целевой контроль или YAP-ТАЗ короткие шпильки РНК. Как и ожидалось, короткие ДНК, ориентированные на YAP и ТАЗ, SARC или PI3 kinase, значительно снижают активность YAP-ТАЗ-TEAD.
Короткие РНК, нацеленные на банкоматы, CDH1, CSK, ERBB2 и гелсолин, увеличили нормализованный уровень люциферазы светлячков в соответствии с опубликованными исследованиями, показывающими, что эти белки были YAP и/или ТАЗ. Несмотря на установленные роли для ATR, CCNE2 и ERBB4 в других типах клеток, короткие РНК шпильки, нацеленные на эти гены, не существенно меняют нормализованные уровни люциферазы светлячков в клетках A375. После этого экрана, идентифицирование регуляторов должны быть проверены с помощью других считывания для их транскрипции фактор деятельности.
Следует также подтвердить эффективный нокдаун выявленного регулятора. Не забудьте соблюдать осторожность и следовать рекомендациям по безопасности при работе с инфекционными лентивирусами, особенно если вирусы являются инфекционными для человека.
