Исследователи ранее создали рекомбинантные вирусы гриппа, которые выражают либо флуоресцентные или биолюминесцентные белковые репортеры. Часть нашего единственного выражения генов репортера в вирусе гриппа серьезно ограничивает его использование в экспериментах. Наш протокол описывает использование вируса бирепортера гриппа, который выражает как флуоресентные, так и биолюминесцентные гены репортера, и, следовательно, преодолевает его ограничение.
Основным преимуществом этого метода является использование одного рекомбинантного вируса гриппа для исследований in vitro и in vivo. При выполнении этого метода, быстрая инъекция люциферазы субстрата и правильное планирование обработки мышей имеет важное значение, потому что субстрат быстро метаболизируется. Также для улучшения обнаружения биолюминесцентного сигнала рекомендуется бритье мышей.
Чтобы заразить мышей, начните с подготовки BIRFLU в 1X PBS. Поддерживайте вирус на льду до прививки. Проверьте на отсутствие рефлекса щепотку ногой, чтобы убедиться, что мышь анестезируется, и привить его интраназально с подготовленным разбавления BIRFLU.
Убедитесь, что все мыши дышат должным образом, прежде чем вернуть их в свои клетки. Откройте программное обеспечение для визуализации и нажмите Initialize, а затем установите параметры, которые будут использоваться для изображения. Чтобы контролировать мышей, инфицированных BIRFLU, брить грудь, чтобы улучшить обнаружение биолюминесцентного сигнала.
После того, как мыши анестезии, использовать 22 калибровочных иглы ретро-орбитально управлять 100 микролитров Nluc luciferase субстрата, разбавленный от одного до 10 в PBS. Сразу же после инъекции поместите животных в изолятор с грудью вверх. Затем поместите изоляционную камеру в инструмент визуализации, закройте дверь и приобретете изображения.
После визуализации верните мышей в клетки и следите за ними до тех пор, пока они полностью не выздоровеют. Используйте инструмент окупаемости программного обеспечения для визуализации для анализа полученных данных о биолюминесценции, навещая область интереса и нажимая на меру. Для выполнения ex vivo изображения легких мыши, собирать легкие в соответствии с рукописными направлениями, начать приобретение изображения программного обеспечения, и установить параметры для изображения.
Как только машина инициализирована, поместите легкие в черный фон лоток, и убедитесь, что ткани отделены друг от друга. Ввемите лоток в изображение, закройте дверь и приобретите изображения. После визуализации немедленно удалите ткани и храните их на льду при четырех градусах цельсия, если образцы будут обработаны в тот же день.
Если они будут обработаны позже, заморозить их быстро в трубке на сухой лед, и хранить их при 80 градусов по Цельсию. Чтобы обработать изображения, выберите инструмент окупаемости инвестиций, нарисуйте области интереса вокруг каждого из отдельных легких и нажмите меру. BIRFLU характеризуется в пробирке, определяя уровни экспрессии Венеры, Нлука и НП в инфицированных клетках.
Выражение Венеры и Нлука обнаруживается только в клетках, инфицированных BIRFLU, в то время как NP выражается как в клетках, инфицированных диким типом PR8, так и в инфицированных БИРФЛУ клетках. В инсценировке инфицированных клеток экспрессия не наблюдается. Кроме того, активность Nluc была измерена в супернатантах культуры тканей в 24, 48, 72 и 96 часов после заражения.
Он обнаруживается уже через 24 часа после инфицирования, а уровень экспрессии увеличивается на 96 часов. Можно также продемонстрировать, что репликационная кинетики BIRFLU сравнима с вирусом PR8 дикого типа. BIRFLU имеет возможность выражать как флуоресцентные и биолюминесцентные гены репортера, и корреляция между ними может быть оценена с помощью in vivo и ex vivo изображения легкого мыши.
Легкие мышей, инфицированных BIRFLU отображается высокая биолюминесценция в виво и флуоресценции ex vivo. Определены также вирусные титеры и генетическая устойчивость BIRFLU in vivo. Анализы бляшек на вирусах из легких мышей показали, что вирус может образовывать бляшки и выражать оба гена репортера.
BIRFLU также может быть использован для оценки эффективности противовирусных и нейтрализующих антител против гриппа. Выход из этих анализов все были коррелированы друг с другом и быстро и легко сделать.
