электропорация мРНК обеспечивает быстрое, эффективное и пространственно и временно контролируемое выражение нескольких белков в системе птичьей модели. Этот метод позволяет более широкое и быстрое выражение флуоресцентных белков, чем маркировка достигается стандартной электропорации ДНК. Электропорация облегчает преходящее открытие пор в плазменной мембране, которые служат проводниками для передачи генетических полезных нагрузок, таких как РНК и ДНК, в клетки многочисленных модельных организмов.
Для первоначальных экспериментов работа с эмбрионами, которые старше, чем день, поскольку они более жесткие и более устойчивы к внешним манипуляциям, как электропорация. На соответствующей стадии эмбрионального развития аккуратно разбейте и вылейте содержимое перепелиного яйца в 10-сантиметровую чашку Петри. Используйте передачу пипетки, чтобы удалить большинство толстых альбумена.
Используйте лабораторные ткани, чтобы аккуратно протереть поверхность ига, чтобы удалить оставшиеся толстые альбумена вокруг эмбриона, чтобы убедиться, что эмбрион будет придерживаться плотно бумажное кольцо. Положите предварительно вырезанную фильтровальную бумагу над эмбрионом и используйте ножницы, чтобы плавно разрезать по периметру эмбриона. Используйте пипетку Pasteur, чтобы слой PPS под эмбрионом, используя нежные потоки, чтобы освободить любое иго прилипания к ткани.
Медленно потяните кольцо бумаги эмбриона под наклонным углом вверх и прочь от ига. Поместите бумагу в чашку Петри, наполненную PBS для дальнейшей очистки. После того, как большая часть ига была удалена, поместите вентраль эмбриона вверх в 35-миллиметровую чашку Петри, покрытую полутвердой смесью агара и альбумена.
Подготовьте электропоральную камеру, подключив черный электрод, заполнив его PBS, и поместив эмбрион внутрь. Используйте стеклянную микрокапильярию, чтобы ввести болюс из 200 нанолитров мРНК в полость между эпибластом и вителлиновой мембраной, покрывающей нужную область. А затем использовать красный электрод для электропората эмбриона.
Поместите электропогрясный эмбрион обратно на смесь агар-альбумена и инкубировать при 38 градусах Цельсия до желаемой стадии развития. Для визуализации электропорации закодированных флуоресцентных белков наблюдать все электропотерированные эмбрионы под флуоресцентным рассечением стереоскопа, чтобы выбрать здоровый и лучший электропотерированный эмбрион для динамических экспериментов изображений. Продолжайте инкубировать другие электроплецированные эмбрионы и неёлпластиные эмбрионы в отдельном инкубаторе.
Кратко промыть выбранный эмбрион с PBS, чтобы удалить любые пузырьки, которые, возможно, сформировались на спинной стороне эмбриона во время электропорации. Поместите очищенный эмбрион непосредственно в изображение блюдо, содержащее тонкий слой около 150 микролитров альбумэн-агара заботиться, чтобы не генерировать пузырьки на спинной поверхности эмбриона. Добавьте небольшой влажный свернутый лист бумаги ткани вдоль внутренних краев изображения тарелки.
Печать блюдо с парафиновой пленкой, чтобы свести к минимуму испарение во время изображения и инкубации. Перемести блюдо быстро на довоенную стадию конфокального микроскопа и используйте канал яркого поля, чтобы найти цветной краситель в эмбрионе. Установите программное обеспечение для визуализации на нужную цель, дихроическое зеркало и спектры выбросов и включите соответствующий лазер.
Позаботьтесь о том, чтобы клетки оставались в видении изображения в течение всего фильма. Используйте достаточно высокое разрешение изображения и убедитесь, что условия изображения не вызывают фототоксичности. Нажмите Live в программном обеспечении изображений и настроить мощность лазера в настройках, которые подходят для интенсивности флуоресценции в зависимости от каждого микроскопа лазерной мощности.
Начните визуализацию эмбриона с помощью 1%лазерной мощности и 800 усиления, увеличивая мощность лазера медленно на 1%increments до тех пор, пока насыщенные пиксели не будут видны. При наблюдении насыщенных пикселей уменьшается мощность лазера до тех пор, пока не будут визуализированы насыщенные пиксели. Изображение эмбриона каждые три-пять минут, чтобы проверить миграцию отдельных клеток через различные точки времени, используя пять микрометров - стеки всей электропластинной области с некоторой дополнительной комнате к нижней части -стек в случае, если эмбрион погружается в кровать агарозы во время сеанса визуализации.
Чтобы наблюдать, как быстро движутся ячейки, проверьте первые несколько точек времени первого фильма. Если ячейки движутся быстрыми темпами, рассмотрите возможность расширения увеличения изображенной области или изображения в другой области. Когда вся электроплитерная область эмбриона была изображена, изображение в неэлектроплатной области одного и того же эмбриона для определения уровней аутофторесценции.
Чтобы определить, как долго трансфицированная мРНК может быть переведена в флуоресцентные белки после подтверждения электропорации гена интереса на стерео микроскопе, поместите эмбрион на разогретую стадию перевернутого конфокального микроскопа и используйте лазер 405 нанометров с 70%-ной мощностью лазера, 100 итерациями и скоростью сканирования от четырех до фотоблейка большей части клеточного флуоресценции. Продолжайте инкубировать эмбрионы на сцене при 36 градусах Цельсия после отбеливания фотографий, заботясь, чтобы обратить внимание на активно делящиеся клетки в пределах фотоотбеленной области, которые обычно видны только в здоровых эмбрионах и, таким образом, указывают на то, что электропорация не навредила эмбриональным клеткам. Приобретайте изображения электроплея в пост-отбеливатель и стек в течение желаемого периода времени с интервалом в три-пять минут.
Для обеспечения того, чтобы условия визуализации не пагубно влияют на выживание эмбриона одновременно инкубировать электроплета эмбрионов, которые не photobleached служить в качестве контроля для изображения. Для количественной оценки результатов фотоотверга для распада мРНК после электропорации используйте ImageJ для измерения интенсивности флуоресценции 7,5 микрометрового круга в центре электроплементной области каждой клетки для отслеживания флуоресценции клеток в течение каждого интервала в три-пять минут. Когда были измерены все клетки в пределах фотоотбеленной области, которые не проходят митоз и были полностью фотоотбелы, участок флуоресценции интенсивности с течением времени после отбеливателя в каждой из точек времени эмбрион был photobleached.
Хотя электропорация ДНК приводит к более яркой флуоресценции в некоторых электроплицитных клетках, эффективность электропорации ДНК заметно ниже по сравнению с широко выраженными мРНК-кодируемых флуоресцентных белков. При сравнении ДНК и мРНК со-электропорации в рамках одного эмбриона, ДНК, выражаюющая флуоресцентную эффективность белка, также значительно и последовательно менее эффективна, чем мРНК, выражаюющая флуоресцентный белок. Количественная оценка всех эмбрионов, пораженных только мРНК, ДНК или комбинацией этих двух, показывает, что мРНК трансфектов составляет около 75% клеток в данной области, в то время как ДНК только трансфекты около 25% клеток.
Трансфицированная мРНК должна привести к более быстрому производству белка по сравнению с трансфицированной ДНК, так как мРНК может быть немедленно распознана цитозольным механизмом перевода. Хотя ко-электропорация нескольких ДНК ранее была показана как относительно неэффективная, ко-электропорация четырех мРНК в этом эксперименте привела к 87%-ной эффективности трансфекции всех четырех мРНК во всех электроплоцнутых регионах. Хотя фотоотбел первоначально снижает интенсивность флуоресценции в фотоотбелевых клетках примерно на 95%, некоторые клетки остаются, которые восстанавливают их способность делиться и выражать флуоресцентные белки вскоре после электропорации.
Эта способность уменьшает над 5 часами столб-электропорация однако. Не то время, оптимизируя лучшие условия изображения и продолжать возиться даже после начала фильма быть готовым внести какие-либо коррективы, если это необходимо.
