Мы благодарим Шломи Криспин для нейронных ЭОП. В частности, мы признаем, Юваль Корица для начала технику GFP трансфекции. Эта работа была поддержана грантами от Израиля научного фонда, ассоциации Francaise контр ле Миопатии и Deutche Forschungsgemeinshaft, совместные научно-исследовательский центр 488 до CK

1. Подготовка Микропипетки Тянем наш пипетки на стандартном Narishige PP-83 пипетки съемник с тепловой установки 13.5. Точная установка должна быть откалибрована, направленных на диаметр кончика пипетки от 8 до 10 мкм. Мы используем нити содержащих боросиликатного стеклянные трубки с внешним диаметром 1,0 мм и внутренним диаметром 0.75-0.78 мм. Пипетки, следовательно, хранится в пластиковой посуды с советами защищен от контакта с края тарелки. 2. Подготовка ДНК Плазмиды интересов трансфицировали в DH5α Е. палочка с помощью стандартных процедур. Ночь культуры из одной колонии используются для очистки плазмид использованием макси-приготовительные комплекты (любой коммерческой комплект должен сделать). Мы используем плазмиды концентрации 1,0 мкг / мкл для не-клональных инъекций. Более высокие концентрации увеличения засорения наконечники для пипеток. Для клональной приложений, плазмиды концентрациях значительно ниже, и должны быть скорректированы (см. ниже). Для pCAGG-GFP, оптимальной концентрации производства клональной результатам было установлено, что около 0,05-0,1 мкг / мкл. От одного до 2 мкл плазмиды обычно используется в эксперименте, и минимальное количество быстрых-зеленый порошок (придерживаясь кончик сухой, резко пипетки стеклянные) добавляется к плазмиды, прежде чем эксперимент начинается. Плазмиду затем центрифугируют в настольной центрифуге в течение 2 минут на максимальной скорости. Эта процедура, кажется, уменьшает пипетки-засорение проблем. 3. Введение эмбрионов 3.1 Подготовка эмбрионов Мы используем перепелов, а также куриные яйца для инъекций. Яйца насиживают лежа на длинной оси до желаемой стадии развития. Яйца протереть 70% этанолом и высушивают. Заостренный конец яйцо прокалывают с хирургическими ножницами (это необходимо только в куриных яйцах) и 1 мл (в перепелов) или 2 мл (цыпленок) белка взята из яйца с 10 мл шприца (19G иглы). Отверстия затем опечатаны с горячим парафином. До фактического инъекции, открывается окно в верхней части яичной скорлупы использованием хирургических ножниц. Размещение липкой ленты на оболочку и проходящем через это может помочь уменьшить мусор из оболочки. PBS буфера, содержащего антибиотики пипеткой непосредственно в яйцеклетку. Чтобы получить доступ эмбриона, желточного и / или амниотической мембраны вырезать и отвлекает использованием 0,14-миллиметровыми штекерами насекомых установлен на иглодержателя. Нетоксичные чернила (Пеликан # 17) вводится под бластодерма, чтобы помочь визуализировать эмбрион, используя пожарные вытащил капиллярной установлен на аспиратор. 3,2 Загрузка и установка микропипетки Съемник микропипетки могут быть загружены с плазмидой огнестрельным вытащил капилляров адекватного диаметра, установлен на аспиратор. Минимальное количество плазмиды рисуется с помощью капиллярного и загружаются в пипетку с момента открытия противоположной заостренным кончиком, и приближается наконечник с внутренней стороны как можно больше. Пипетки, следовательно, загружены на ручной давления воздуха инжектор монтируется на микроманипулятора. Минимальное давление применяется, если это необходимо, для того, чтобы позволить плазмиды решение для достижения кончика пипетки. 3,3 плазмиды инъекции Пипетки манипулируют в жидкой среде яйца при применении некоторых давление воздуха, чтобы предотвратить засорение кончика пипетки. Соответствующие домена ткани пронзили. Изменение давления, как кончик входит ткань достаточно часто, чтобы освободить плазмиды с видимым быстро зеленый. Если это не так, затем слегка давлением шприца до плазмиды / быстро зеленые выбрасываются. Этот процесс может повторяться вдоль оси эмбриона, например, в соседних сомитов или по степени нервной трубки. После инъекции, PBS может быть добавлен. Окна запечатаны использованием липкой ленты (парафильмом не желательно, особенно для перепелиных яиц повышает ставки зародыш смерти, возможно, блокируя обмен кислорода через оболочку). Лечение эмбрионов возвращаются в инкубатор. Избегайте вентиляции и разместить небольшие емкости с водой в инкубаторе, поскольку они помогают сохранить влагу и повышения урожайности. 4. Настройка параметров впрыска и мониторинг показателей успешности Asessing и калибровки различных параметров инъекции имеет решающее значение для приложений, направленных на одноклеточных анализа. Не каждая инъекция событие приведет к успешной маркировки одной ячейки. Плазмиды концентрации, которая слишком высока, может привести к не-клональных маркировки, в то время очень низких концентрациях приводить к высоким показателям недостаточности. Концентрация вводят плазмиды должна быть оптимизирована для клональной инъекций. Мы рекомендуем разбавление всей очищенной плазмиды акции, а не разбавляя отдельных подготавливает к заранее определенной концентрации. Последнийможет ввести некоторые различия успеха ставок, вероятно, из-за изменений в чистоте и другие параметры, такие как доля суперспиральной плазмиды. 4,1 Оценка успеха ставки на весь наблюдения горе Первоначальная оценка вводят эмбрионов может быть выполнен весь монтаж наблюдения под флуоресцентным бинокль. От шести до восьми часов после инъекции являются достаточными для оценки успеха ставки с pCAGG повышенной GFP конструкции. Это предусмотрено целевой сайт поверхностно достаточно, чтобы быть очевидной (например, спинной сомитов, спинной нервной трубки, эктодермы и т.д., см. Рисунок 1A-C.). Этот шаг является особенно полезным для оценки экспериментальных серий экспонирование либо слишком много меченых клеток или, наоборот, не имея флуоресцентных клеток. Если в дальнейшем инкубации желательно, антибиотики содержащие PBS раствор должен быть добавлен в яйце после просмотра и уплотнительная лента должны быть заменены. 4,2 Оценка клональности по серийному сечения анализ Лучшее средство для оценки темпов успешных инъекций является серийно-секционирования вводят эмбрионов и использование иммуногистохимии для визуализации меченых клеток. В этих условиях, времени инкубации может быть как 4-х часов после инъекции. Эмбрионов фиксируются и обрабатываются для парафиновых срезов (или cryosectioning). Стекло монтажа разделы затем де-paraffinized и иммуно-витражи для репортера визуализации. Усиление методы, такие как биотин-стрептавидин было бы желательно. Наконец, серийных срезов, проверяются для обнаружения меченых клеток в вводили сегментов. Если после первоначального испытания нескольких, а не отдельные клетки получены, плазмиды запас должен быть разведен, и процесс повторяется, пока адекватные результаты будут достигнуты. От двух до 10-кратного разведения плазмиды маточного раствора может оказаться необходимым в случае успеха ставки слишком высоки. Для каждой плазмиды для трансфекции, тщательная калибровка, что гарантирует клональности следует повторить. 5. Представитель Результаты Мы обычно проводят однократное введение pCAGG-GFP в сегмент, в то время таргетинга 6-12 сегментов в эмбрионе 1 2. Под этот параметр, четкий сигнал может быть обнаружен целый наблюдения гору 8 часа после инъекции, хотя бы в одном сегменте одного эмбриона из десяти. В этих условиях, маркировка было дополнительно подтверждено быть клональной (рис. 1В, С). При использовании высоких концентраций ДНК, большинство эмбрионов могут проявлять хотя бы один успешный инъекции, повышение возможности того, что несколько ячеек были трансфекции. Последовательный анализ показал, что раздел клональной трансфекции были достигнуты, когда вероятность успеха была около 10%. Это означает, что для достижения клональности, техника по определению, крайне неэффективно. С другой стороны, в этих условиях, более 93% положительных событий маркировки оказались клональной 1. <img src="/files/ftp_upload/2133/2133fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Клональный инъекции pCAGGS-GFP в нервные и скелетных прародителей. (AC) поперечном разрезе показывает маркировка спинной нервной трубки (NT) (), вентролатеральной области dermomyotome (DM) (В), или центральная DM лист (С) , 6hr после микроинъекции pCAGGS-GFP к одному прародителя. (D) два дня после клональной трансфекции центральном ДМ, одного прародителей порожденных производных в обоих дермы (D), а также мышцы (М) (см. ссылку 1. Подробнее).

<ol>
	<li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+analysis+of+the+avian+dermomyotome+sheet+reveals+the+existence+of+single+cells+with+both+dermal+and+muscle+progenitor+fates.">Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates.</a> Development. 132, 689-701 (2005).</li><li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+bone+morphogenetic+protein+differentially+act+on+dermomyotome+cells+to+generate+endothelium,+smooth,+and+striated+muscle.">Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle.</a> J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).</li><li>Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+early+development+of+specific+hypaxial+muscles+from+the+ventrolateral+myotome.+.">Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. .</a> Development. 126, 4305-4315 (1999).</li><li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+green+fluorescent+protein+as+a+single-cell+marker+in+living+embryos.">Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos.</a> Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Dev Biol. 305, 616-624 (2007).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Описанный выше метод является модификацией ранее описанной техники для доставки липофильных красителей малого подмножества клеток или одной прародителей 3. Она имеет три основных преимущества по сравнению со стандартной техникой электропорации. Во-первых, она предоставляет ср...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Pipette tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>B100-75-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillaries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific</td>
<td>2-000-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insect needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Watkins &amp; Doncaster</td>
<td>E6871</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen-Strep solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biological Industries</td>
<td>03-031-1B</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

single cell transfection in chick embryos

Центральной темой в биологии развития, является диверсификация линий и выяснение основных молекулярных механизмов. Это влечет за собой тщательный анализ судьбы отдельных клеток в норме и при экспериментальных условиях. С этой целью трансфекции методы, ориентированные одного прародителями являются необходимым условием. Мы описываем здесь технически простой метод трансфекции клеток в одной куриной ткани-ово, позволяя надежной линии трассировки, а также генетических манипуляций. Конкретные области ткани направлены в сегмент или нервной трубки, и ДНК вводится непосредственно в эпителии интерес, в результате спорадических трансфекции отдельных клеток. Использование репортеров, клональной населению, могут, следовательно, быть прослежены на срок до трех дней, и поведение генетически модифицированных клональной популяции могут быть по сравнению с контролем. Этот метод использует преимущества доступности куриного эмбриона, а также новые инструменты для генетических манипуляций. Мы сравниваем и обсудить его преимущества по сравнению с широко используемым методом электропорации, и возможные применения и использования в дополнительной в естественных условиях модели также предложил. Мы выступаем за использование этого метода, как существенное дополнение и дополнить существующие линии отслеживания и генетических инструментов вмешательства.

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Transfection in Chick Embryos at JoVE.com

Single Cell Transfection in Chick Embryos

Использование тонких кончика микропипетки мы вводим плазмиды ДНК в подобластях куриного сомитов или нервных трубок. Концентрация плазмиды регулируется для получения одного трансфекции клеток. Затем мы позволить клеткам развиваться в клональных популяций.

Одноместный Трансфекция сотовый на куриных эмбрионах

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

single-cell-transfection-in-chick-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K Views.  Hadassah Medical School - Hebrew University. Использование тонких кончика микропипетки мы вводим плазмиды ДНК в подобластях куриного сомитов или нервных трубок. Концентрация плазмиды регулируется для получения одного трансфекции клеток. Затем мы позволить клеткам развиваться в клональных популяций.

Video: Single Cell Transfection in Chick Embryos

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Препарирование 6,5 Эмбрионы DPC мышь

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

В Ovo Electroporations Его Святейшества Стадия 10 эмбрионов куриного

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Метод культуры раннего куриных эмбрионов исключая виво (Новая Культура)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Дважды Всего горе на месте гибридизация раннего куриных эмбрионов

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Подготовка эмбрионов для электронной микроскопии Drosophila Эмбриональные трубки сердца

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Одноклеточный Всасывающая Recordings от фоторецепторов Мышь Конус

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Два-Фотон основе Фотоактивация в Живом данио рерио Эмбрионы

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Изображениями сотовый изменения формы в живых Drosophila Эмбрионы

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Одно отображение Судьба сотового у рыбок данио

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Трансплантация лица в<em&gt; Xenopus Laevis</em&gt; Эмбрионы

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...