Изоляция фенотипического анализа иммунных клеток из кишечника с помощью этого протокола доказала свою применимость к пониманию ГИ и системных воспалительных расстройств. Этот метод изолирует значительное количество жизнеспособных моноядерных клеток, минимизируя загрязняющий мусор, позволяющий последующее иммунное фенотипирование атомистики Флера или другими методами. Поскольку кишечник является основным целевым местом воспаления при многих заболеваниях, этот протокол может быть полезен для изучения кишечных иммунных популяций в мышиных моделях рака, аллергии, трансплантации и аутоиммунных заболеваний.
Для оптимизации урожайности и эффективности этого протокола рекомендуется заранее подготовить ключевые решения и материалы, как отмечалось. После усыпания мыши и сделать вертикальный разрез средней линии, используйте тонкие ножницы вскрытия, чтобы открыть брюшной полости. Используя типсы, переместить мелкий кишечник в одну сторону и подвергать нисходящей толстой кишки.
Потяните вверх немного на нисходящей толстой кишки, чтобы максимально разоблачить ректальной части толстой кишки. Затем, сократить дистальной прямой кишки глубоко в таз и вскрыть всю толстую кишку, как одна единица от дистальной прямой кишки к cecal крышку. Во-первых, поместите толстой кишки на увлажнено бумажное полотенце и использовать тупой конец ножницы или типсы применять мягкое давление на стенку кишечника и извлечь твердый стул.
Затем поместите толстую кишку в чашку Петри и используйте 10 миллилитров шприц с 18-го калибра тупой заполненной иглой, чтобы промыть кишечник с 10 миллилитров охлажденного буфера толстой кишки. Поместите толстую кишку в чашку Петри, наполненную 5-10 миллилитров охлажденного буфера толстой кишки и агитировать вручную мыть оставшееся содержимое толстой кишки. Повторите эту стирку 2-3 раза, используя новую чашку Петри, содержащую свежий буфер для каждой стирки.
После этого перенесите толстую кишку в новую чашку Петри, содержащую свежий охлажденный буфер толстой кишки. Вырезать толстой кишки продольно от его более мышечной ректальной конца проксимальной толстой кишки, чтобы создать один прямоугольный открытый кусок толстой кишки. Откажитесь от медианы в блюде и замените ее чистым охлажденным буфером толстой кишки.
Поместите прямоугольную ткань толстой кишки на бумажное полотенце, которое увлажняется буфером толстой кишки и разрежьте его, нарезая его горизонтально, а затем на мелкие фрагменты. Используйте тонкие типсы для сбора фрагментов толстой кишки в 50 миллилитров полипропиленовой конической трубки, содержащей 20 миллилитров охлажденного буфера толстой кишки. Затем, мыть фрагменты энергично закрученного трубки в течение 30 секунд.
После мытья, пусть фрагменты ткани оседают на дно трубки, прежде чем декантировать или вакуум, аспирирующий супернатант, убедившись, чтобы избежать потери фрагментов тканей, повторить весь этот процесс мытья 3 раза с помощью свежего буфера толстой кишки для каждой стирки. Для начала добавьте 20 миллилитров буфера пищеварения коллагеназы в трубку, содержащую вымытые фрагменты толстой кишки. Запечатай трубку и поместите ее в орбитальный шейкер при 37 градусах Цельсия со скоростью вращения 2 раза G в течение 60 минут.
Убедитесь, что фрагменты тканей находятся в постоянном движении во время агитации. Во-первых, залить 5 миллилитров 66%кремнезема на основе плотности разделения средств массовой информации в каждом из 3 отдельных 15 миллилитров полипропилена труб. Далее используйте 25 миллилитров серологического пипетки, чтобы собрать только супернатант из коллагеназы пищеварения 1.
Фильтр супернатант через 40 микролитр бедных фильтрации ткани клеток ситечко помещается в чистую 50 миллилитров полипропиленовой конической трубки. Заполните трубку полностью с охлажденным буфером толстой кишки, чтобы утолить буфер пищеварения коллагеназы. Затем спина клетки, аспирировать супернатант, и держать гранулы на льду.
Продолжайте выполнять коллагеназное пищеварение 2, как указано в текстовом протоколе. После того, как коллагеназа пищеварения 2 завершена, промыть фрагменты тканей энергично туда и обратно между трубкой и 10 миллилитров шприц через 18-го калибра тупой иглы конца. Повторите этот флеш, по крайней мере 7-8 проходов, продолжая до тех пор, пока не будут видны грубые фрагменты ткани или дебри.
Далее, пройти подвески дезагрегации тканей через 40 микрометров бедных фильтрации ткани клеток ситечко помещается в чистую 50 миллилитров полипропиленовой трубки. Заполните трубку обода с охлажденным буфером толстой кишки, чтобы утолить пищеварение и центрифугу при 800 раз G при 4 градусах по Цельсию в течение 5 минут. Отбросьте супернатант через вакуумное аспирации и потяните повторно приостановленные гранулы из коллагеназы пищеварения 1 к соответствующей трубке.
После этого, повторно приостановить каждую гранулу в 24 миллилитров 44%кремнезема на основе плотности разделения средств на толстую кишку. Используйте 10 миллилитров серологического пипетки медленно слой 8 миллилитров этого средства массовой информации на каждой из 3 трубок, содержащих 66%кремнезема на основе плотности разделения средств массовой информации. Тщательно сбалансировать трубки в ведрах центрифуги с помощью шкалы взвешивания или баланса.
Центрифуга при 859 градусах G при 20 градусах по Цельсию в течение 20 минут без перерыва. Позвольте родекам прийти к полному отдыху перед удалением трубок, заботясь о том, чтобы не нарушить работу ячеек на градиенте интерфейса. Во-первых, визуализировать интерфейс градиента вблизи 5 миллилитров знак, где обычно 1-2 миллилитров толщиной белая полоса присутствует.
Вакуумный аспират и отбросить верхние 7 миллилитров градиента, чтобы облегчить доступ пипетки к интерфейсу. Используя непрерывное ручное всасывание и устойчивое вращающееся движение запястья, соберите интерфейсный слой клеток. Соберите до тех пор, пока интерфейс между двумя градиентами не будет ясным и рефракционным и не перенесите интерфейс в новую 50-миллилитровую полипропиленовую коническую трубку.
Затем добавьте FACS Buffer в эту ванну до тех пор, пока общая подвеска не достигнет 50 миллилитров. Центрифуга при 800 градусах G при 4 градусах Цельсия в течение 5 минут. Затем, аспирировать супернатант через вакуумное аспирации и повторно приостановить гранулы в 1 миллилитр FACS Buffer.
Процедура, описанная в этом видео, может быть использована для изоляции моноядерных клеток из толстой кишки или, с изменениями, из тонкой кишки. Кроме того, цитометрия и анализ данных выполняется для сравнения фракций апоптотических и некротических / мертвых лимфоцитов при использовании коллагеназы E или D для изоляции, с нашим без ЛЕЧЕНИЯ DNAse 1. После Приложения 5 и починки живых мертвых синих красителей окрашивания на одноклеточных суспензий после каждой изоляции, Collagenase E без DNAse показал значительно более высокий процент живых клеток после изоляции по сравнению с Collagenase D без DNAse.
Даже по сравнению с коллагеназой с ДНК. Кроме того, мы определили некротические клетки со средним процентом 41,0% в группе Collagenase E против 90,0% в группе Collagenase D. 75,9% в группе Collagenase E DNAse и 80,3% в группе Collagenase D DNAse.
Мульти периметрическая цитометрия потока затем применяется к MNC изолированы от CD45.2 клапан-C получателя мышей на 7-й день после получения BMT или либо аллогенных или сингенетических моделей BMT. Средние абсолютные числа доноров CD4 положительные и CD8 положительные Т-клетки, извлеченные из толстой кишки получателя BMT рассчитываются и сравниваются. Таким образом, это может быть важно для выявления и / или количественно редких популяций иммунных клеток в таких моделях мыши.
Редкие подмножества, в том числе донорские производные FOX-P3 положительные Т-регуляторные клетки оцениваются как в сингенных, так и в аллогенных моделях БМТ. Используя этот метод, даже редкие подмножества, такие как донор полученных толстой кишки T нормативных проникновения реципиента мыши толстой кишки, после BMT, могут быть проанализированы. Следует отметить, что Коллагеназа E активна при 37 градусах Цельсия.
Таким образом, все растворы коллагеназы должны быть предварительно разогреты для адекватной активности коллагеназы и тщательно утоляются, чтобы прекратить активность. Этот протокол позволяет большое количество моноядерных клеток, которые могут быть использованы для последующей характеристики Флер цитометрии, молекулярной биологии методы, микроскопия, культура, и сайт, среди других. Этот протокол обеспечил надежную оценку воспаления в толстой кишке экспериментальных против контролируемых мышей в модели трансплантации костного мозга.
Тем самым способствуя открытию новых регуляторных иммунных механизмов толерантности к трансплантации. Коллагеназа из Clostridium Istoliticum является реагентом, который должен быть обработан с лабораторными методами безопасности. Он представляет опасность для здоровья при вдыхании и может вызвать раздражение кожи и глаз.
