使用胶原酶E从毛里结肠分离拉米纳普里亚单核细胞

使用本协议对肠道免疫细胞进行表型分析的分离已证明适用于对GI和全身性炎症性疾病的理解。这种方法通过最大限度地减少污染碎片，通过Fleur的阿托米斯特里或其他方法进行后续免疫表型，分离出大量可行的单核细胞。由于肠道是许多疾病炎症的主要靶点，此协议可能有助于研究小鼠癌症、过敏、移植和自身免疫模型中的肠道免疫群。

为了优化本协议的产量和效率，建议提前准备关键解决方案和材料。对鼠标进行安乐死并进行垂直中线切口后，使用精细的解剖剪刀打开内膜。使用钳子，将小肠移动到一侧，并公开下降结肠。

在下降的结肠上稍微向上拉，以最大地暴露结肠的直肠部分。然后，切开骨盆深处的远毛直肠，将整个结肠解剖为从远毛直肠到切毛帽的一个单元。首先，将结肠放在湿润的纸巾上，用一把剪刀或钳子的钝端对肠壁施加轻度压力，并提取固体凳子。

接下来，将结肠放在培养皿中，使用10毫升注射器，用18个量表的钝填充针头用10毫升的冷冻结肠缓冲液冲洗肠道。将结肠放在装满 5-10 毫升冷冻结肠缓冲液的培养皿中，并手动搅拌以清洗剩余的结肠内。重复此洗涤 2-3 次，使用新的培养皿，每次洗涤都含有新鲜缓冲液。

在此之后，将结肠转移到含有新鲜冷冻结肠缓冲液的新培养皿中。将结肠纵向从其肌肉更发达的直肠端切到近端结肠，以生成单个矩形开放结肠片。丢弃盘中的中位数，用干净的冷冻结肠缓冲液替换。

将矩形结肠组织放在纸巾上，用结肠缓冲液润湿，然后水平切开，然后切成小块。使用细钳将结肠碎片收集到含有 20 毫升冷冻结肠缓冲液的 50 毫升聚丙烯锥形管中。然后，通过大力旋转管子 30 秒来清洗碎片。

洗涤后，让组织碎片沉淀到管底，然后或吸尘，确保避免失去组织碎片，每次洗涤使用新鲜结肠缓冲液重复整个洗涤过程 3 次。首先，在含有洗涤结肠片段的管子中加入20毫升的胶原酶消化缓冲液。密封管，并在37摄氏度的轨道摇床中放置，旋转速率为2倍G，旋转60分钟。

确保组织片段在搅拌过程中保持恒定运动。首先，将 5 毫升 66%硅基密度分离介质倒入 3 个单独的 15 毫升聚丙烯管中。接下来，使用25毫升血清移液器只收集从胶原蛋白消化的上流水液1。

通过 40 微升滤液纤维滤芯过滤器过滤上清液，放入清洁的 50 毫升聚丙烯锥形管中。将管子完全填充冰镇结肠缓冲液，以淬火胶原酶消化缓冲液。然后旋转细胞，吸上一液，并保持在冰上的颗粒。

继续执行文本协议中概述的胶原蛋白酶消化 2。胶原蛋白消化2完成后，通过18规格的钝端针在管子和10毫升注射器之间大力冲洗组织片段。重复此冲洗至少 7-8 通道，一直持续到看不到毛组织碎片或脱布里。

接下来，通过一个40微米差的过滤织物细胞过滤器，将组织分解悬浮液放入一个干净的50毫升聚丙烯管中。将管子填充到边缘，用冷却结肠缓冲液在4摄氏度下以800次G加热和离心5分钟。通过真空吸气丢弃上经剂，将胶原蛋白消化液消化 1 中重新悬浮的颗粒拉到相应的管中。

在此之后，将每个颗粒重新悬浮在 24 毫升 44%硅基密度分离介质中。每个结肠。使用 10 毫升血清移液器将该介质的 8 毫升缓慢分层到包含 66% 硅基密度分离介质的 3 根管上。使用称重刻或平衡器小心平衡离心桶内的管。

在20摄氏度的859倍G下离心20分钟，不休息。在取出管子之前，让棒子完成休息，注意不要破坏梯度界面的细胞。首先，可视化 5 毫升标记附近的梯度接口，通常存在 1-2 毫升厚的白色带。

真空吸气并丢弃梯度前 7 毫升，以便更方便地接触移液器。使用连续的手动吸力和稳定旋转的手腕运动，收集细胞的界面层。收集，直到两个梯度之间的接口是清晰和折射，并转移接口到一个新的50毫升聚丙烯圆锥形管。

接下来，将 FACS 缓冲液添加到此浴缸，直到总悬浮液达到 50 毫升。在 4 摄氏度下在 800 倍 G 下离心 5 分钟。然后，通过真空吸气吸上经液，并在1毫升的FACS缓冲液中重新悬浮颗粒。

本视频中描述的程序可用于从结肠中分离单核细胞，或者通过修改从小肠分离出单核细胞。此外，在使用胶原蛋白酶E或D进行分离时，使用非DNA酶1治疗，进行细胞切除术和数据分析，以比较凋亡和坏死淋巴细胞的分数。继附件5和可修复活死蓝色染料染色单细胞悬浮液后，每次分离后，与没有DNAse的胶原酶D相比，分离后没有DNAse的胶原酶E显示的活细胞比例要高得多。

即使与DNA酶的胶原酶相比。此外，我们在胶原酶E组中以41.0%的中位数百分比识别坏死细胞，而在胶原蛋白D组中，这一比例为90.0%。75.9%在胶原酶E DNAse组和80.3%在胶原酶DDNAse组。

然后，在收到 BMT 或异构或合成 BMT 模型后，在第 7 天将多近位流量细胞学应用于从 CD45.2 气门-C 接收小鼠分离的 MNC。计算和比较了从BMT接受者结肠中提取的捐赠者CD4阳性和CD8阳性T细胞的均数。因此，在这样的小鼠模型中识别和/或量化稀有免疫细胞种群非常重要。

稀有子集，包括供体衍生的FOX-P3阳性T调控细胞在合成和异体BMT模型中进行评估。使用此方法，甚至可以分析罕见的子集，如供体派生结肠T调控渗透接受者小鼠结肠后，BMT。应该注意的是，胶原酶E在37摄氏度下是活跃的。

因此，所有胶原酶溶液应预先加热，以充分胶原酶活性，并彻底淬火以终止活性。该协议允许大量的单核细胞，可用于后续表征的弗勒尔细胞学，分子生物学技术，显微镜，培养，和位点，等等。该协议提供了一个可靠的评估炎症在实验鼠与受控小鼠在骨髓移植模型。

从而促进移植耐受性新型调节免疫机制的发现。来自梭菌的胶原蛋白酶是一种应采用实验室安全技术处理的试剂。吸入后会对健康造成危害，并可能导致皮肤和眼睛刺激。