O isolamento na análise fenotípica das células imunes do intestino usando este protocolo tem se mostrado aplicável à compreensão de GI e distúrbios inflamatórios sistêmicos. Este método isola um número significativo de células mononucleares viáveis minimizando detritos contaminantes permitindo fenotipagem imunológica subsequente pela Atomistry de Fleur ou outros métodos. Como o intestino é um dos principais alvos de inflamação em muitas doenças, esse protocolo pode ser útil para o estudo de populações imunes intestinais em modelos de camundongos de câncer, alergia, transplante e autoimunidade.
Para otimizar o rendimento e a eficiência deste protocolo, recomenda-se que as principais soluções e materiais sejam preparados com antecedência, como observado. Depois de eutanásia do mouse e fazer uma incisão vertical midline, use uma tesoura de dissecção fina para abrir o peritônio. Usando fórceps, mova o intestino delgado para um lado e exponha o cólon descendente.
Puxe ligeiramente para cima sobre o cólon descendente para expor ao máximo a porção reta do cólon. Em seguida, corte o reto distal profundo na pélvis e disseque todo o cólon como uma unidade do reto distal até a tampa cecal. Primeiro, coloque o cólon sobre uma toalha de papel umedecido e use a extremidade cega de um par de tesouras ou fórceps para aplicar uma pressão leve na parede intestinal e extrair as fezes sólidas.
Em seguida, coloque o cólon em uma placa de petri e use uma seringa de 10 mililitros com uma agulha enchada de calibre 18 para lavar o intestino com 10 mililitros de tampão de cólon resfriado. Coloque o cólon em uma placa de petri cheia de 5-10 mililitros de tampão de cólon resfriado e agitar manualmente para lavar o conteúdo colonial restante. Repita esta lavagem 2-3 vezes, usando uma nova placa de petri contendo tampão fresco para cada lavagem.
Depois disso, transfira o cólon para uma nova placa de petri contendo tampão de cólon fresco refrigerado. Corte o cólon longitudinalmente de sua extremidade retal mais muscular para o cólon proximal, para gerar uma única peça retangular de cólon aberto. Descarte a mediana no prato e substitua-a por um tampão de cólon resfriado limpo.
Coloque o tecido retangular do cólon sobre uma toalha de papel que é umedecido com tampão de cólon e corte-o cortando-o horizontalmente e, em seguida, em pequenos fragmentos. Use fórceps finos para coletar os fragmentos de cólon em um tubo cônico de polipropileno de 50 mililitros contendo 20 mililitros de tampão de cólon refrigerado. Em seguida, lave os fragmentos girando vigorosamente o tubo por 30 segundos.
Após a lavagem, deixe os fragmentos de tecido se acomodarem na parte inferior do tubo antes de decantar ou aspirar o aspirador do supernadante, certificando-se de evitar perder fragmentos de tecido, repita todo esse processo de lavagem 3 vezes usando tampão de cólon fresco para cada lavagem. Para começar, adicione 20 mililitros de tampão de digestão de colagenase ao tubo contendo os fragmentos de cólon lavados. Sele o tubo e coloque-o em um agitador orbital a 37 graus Celsius com uma taxa de rotação de 2 vezes G por 60 minutos.
Certifique-se de que os fragmentos de tecido estão em constante movimento durante a agitação. Primeiro, despeje 5 mililitros de 66% de mídia de separação de densidade à base de sílica em cada um dos 3 tubos de polipropileno separados de 15 mililitros. Em seguida, use uma pipeta sorológica de 25 mililitros para coletar apenas o supernatante da Digestão De Colagenase 1.
Filtre o supernatante através de um coador de células de tecido de filtragem de 40 microliteres pobres colocado em um tubo concético de polipropileno limpo de 50 mililitros. Encha o tubo completamente com tampão de cólon refrigerado para saciar o tampão de digestão da colagemnase. Em seguida, gire as células, aspire o supernante, e mantenha a pelota no gelo.
Continue a executar a Digestão de Colagem 2 conforme descrito no protocolo de texto. Depois que a Digestão de Colagenase 2 for concluída, lave os fragmentos de tecido vigorosamente para frente e para trás entre o tubo e uma seringa de 10 mililitros através de uma agulha final sem calibre de 18. Repita esta descarga por pelo menos 7-8 passagens, continuando até que nenhum fragmento de tecido bruto ou debri seja visível.
Em seguida, passe a suspensão de desagregação do tecido através de um coador de células de tecido de filtragem de 40 micrômetros colocado em um tubo limpo de polipropileno de 50 mililitros. Encha o tubo até a borda com tampão de cólon resfriado para saciar a digestão e centrífuga a 800 vezes G em 4 graus Celsius por 5 minutos. Descarte o supernatante através da aspiração de vácuo e puxe a pelota suspensa de Colagenase Digestion 1 para o tubo correspondente.
Depois disso, suspenda cada pelota em 24 mililitros de 44% de mídia de separação de densidade baseada em sílica por cólon. Use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para lentamente colocar 8 mililitros desta mídia em cada um dos 3 tubos contendo mídia de separação de densidade baseada em 66% de sílica. Equilibre cuidadosamente os tubos dentro de baldes centrífugas usando uma balança de pesar ou um equilíbrio.
Centrifugar a 859 vezes G em 20 graus Celsius por 20 minutos sem o intervalo. Deixe que os roders se concluam antes de remover os tubos, tomando cuidado para não interromper as células na interface gradiente. Primeiro, visualize a interface gradiente perto da marca de 5 mililitros, onde tipicamente uma faixa branca de 1-2 mililitros de espessura está presente.
Aspirar a vácuo e descartar os 7 mililitros superiores do gradiente para permitir um acesso mais fácil à pipeta à interface. Usando sucção manual contínua e movimento de pulso rotativo constante, colete a camada de interface das células. Colete até que a interface entre os dois gradientes esteja clara e refrátil e transfira a interface para um novo tubo cônico de polipropileno de 50 mililitros.
Em seguida, adicione o TAMPÃO FACS a esta banheira até que a suspensão total atinja 50 mililitros. Centrifugar a 800 vezes G em 4 graus Celsius por 5 minutos. Em seguida, aspire o supernatante via aspiração de vácuo e suspenda novamente a pelota em 1 mililitro de TAMPÃO FACS.
O procedimento descrito neste vídeo pode ser usado para isolar células mononucleares do cólon ou, com modificações, do intestino delgado. Além disso, a citometria e a análise de dados são realizadas para comparar as frações de linfócitos apoptóticos e necrotóticos/mortos ao usar colagenase E ou D para o isolamento, com o nosso tratamento sem DNAse 1. Após o Anexo 5 e a coloração de corante azul morto fixável em suspensões de células únicas após cada isolamento, a Collagenase E sem DNAse mostrou uma porcentagem significativamente maior de células vivas após o isolamento quando comparada com a Colagenase D sem DNAse.
Mesmo quando comparado com qualquer colagenase com DNAse. Além disso, identificamos células necróticas em um percentual mediano de 41,0% no grupo Colagenase E contra 90,0% no grupo Colagenase D. 75,9% no grupo Collagenase E DNAse e 80,3% no grupo Colagenase DNAse.
A citometria de fluxo multiimétrico é então aplicada à MNC isolada de camundongos receptores de válvula CD45.2 no dia 7 após receber modelos de BMT ou BMT aogênicos ou sinagênicos. Os números absolutos médios de células T positivas do CD4 doador e CD8 extraídos do cólon do receptor de BMT são calculados e comparados. Por isso, pode ser importante identificar e/ou quantificar populações raras de células imunes nesses modelos de camundongos.
Subconjuntos raros, incluindo células reguladoras T positivas FOX-P3 derivadas de doadores são avaliados em modelos de BMT síngênico e alogênico. Usando este método, até mesmo subconjuntos raros, como o cólon colonico derivado de doador, infiltrando-se no cólon do rato receptor, após o BMT, podem ser analisados. Deve-se notar que a Colagenase E está ativa a 37 graus Celsius.
Assim, todas as soluções de colagenase devem ser pré-aquecidas para atividade de colagem adequada e completamente saciadas para encerrar a atividade. Este protocolo permite um grande número de células mononucleares que podem ser usadas para caracterização subsequente por uma citometria fleur, técnicas de biologia molecular, microscopia, cultura e local de, entre outros. Este protocolo forneceu uma avaliação confiável da inflamação no cólon de camundongos experimentais versus controlados em um modelo de transplante de medula óssea.
Facilitando assim a descoberta de novos mecanismos imunológicos regulatórios da tolerância ao transplante. Collagenase de Clostridium Istoliticum é um reagente que deve ser tratado com técnicas de segurança de laboratório. Representa um risco para a saúde quando inalado e pode causar irritação na pele e nos olhos.
