בידוד בניתוח פנוטיפי של תאים חיסוניים מהמעי באמצעות פרוטוקול זה הוכיחו את עצמם ישימים להבנת GI והפרעות דלקתיות מערכתיות. שיטה זו מבודדת מספר משמעותי של תאים חד-גרעיניים בני קיימא על ידי מזעור פסולת מזהמת המאפשרת פנוטיפים חיסוניים עוקבים על ידי האטומיסטריה של פלר או שיטות אחרות. כמו המעי הוא אתר היעד העיקרי של דלקת במחלות רבות, פרוטוקול זה עשוי להיות שימושי לחקר אוכלוסיות החיסון במעיים במודלים העכבר של סרטן, אלרגיה, השתלה, אוטואימוניות.
כדי לייעל את התשואה והיעילות של פרוטוקול זה, מומלץ להכין מראש פתרונות וחומרים מרכזיים. לאחר המתת לחץ הפוך את העכבר עושה חתך קו האמצע אנכי, להשתמש מספריים ניתוח עדין כדי לפתוח את peritoneum. באמצעות מדפים, להעביר את המעי הדק לצד אחד ולחשוף את המעי הגס היורד.
משוך כלפי מעלה מעט על המעי הגס היורד כדי לחשוף באופן מקסימלי את החלק רקטלי של המעי הגס. לאחר מכן, חותכים את פי הטבעת הדיסטלי עמוק באגן וחותכים את המעי הגס כולו כיחידה אחת מהפי הטבעת הדיסטלית לכסה ה- cecal. ראשית, מניחים את המעי הגס על מגבת נייר לחה ולהשתמש בקצה הקהה של זוג מספריים או מטחנים כדי להחיל לחץ קל על דופן המעי ולחלץ את הצואה מוצק.
לאחר מכן, מניחים את המעי הגס בצלחת פטרי ולהשתמש מזרק 10 מיליליטר עם מחט 18-מד קהה מלא כדי לשטוף את המעיים עם 10 מיליליטר של חיץ המעי הגס צונן. מניחים את המעי הגס בצלחת פטרי מלא 5-10 מיליליטר של חיץ המעי הגס צונן להתסיס באופן ידני כדי לשטוף את התוכן המעי הגס הנותר. חזור על שטיפה זו 2-3 פעמים, באמצעות צלחת פטרי חדשה המכילה חיץ טרי לכל שטיפה.
לאחר מכן, מעבירים את המעי הגס לצלחת פטרי חדשה המכילה חיץ מעי גס צונן טרי. חותכים את המעי הגס אורך מקצה רקטלי שרירי יותר שלה המעי הגס proximal, כדי ליצור חתיכת המעי הגס פתוח מלבני יחיד. משליכים את החציון בצלחת ומחליפים אותו במאגר המעי הגס הצונן והנקי.
מניחים את רקמת המעי הגס המלבנית על מגבת נייר כי הוא לח עם חיץ המעי הגס לחתוך אותו על ידי חיתוך אופקי ולאחר מכן לתוך שברים קטנים. השתמש ממטרות בסדר כדי לאסוף את שברי המעי הגס לתוך צינור חרוט פוליפרופילן 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר של חיץ המעי הגס צונן. לאחר מכן, לשטוף את השברים על ידי מערבולת נמרצת את הצינור במשך 30 שניות.
לאחר הכביסה, תן שברי הרקמה להתיישב לתחתית הצינור לפני decanting או ואקום שאפת supernatant, הקפד להימנע לאבד שברי רקמות, לחזור על כל תהליך לשטוף את כל זה 3 פעמים באמצעות חיץ המעי הגס טרי עבור כל לשטוף. כדי להתחיל, להוסיף 20 מיליליטר של מאגר עיכול קולגן לצינור המכיל את שברי המעי הגס שטף. לאטום את הצינור ולמקום אותו שייקר מסלולית ב 37 מעלות צלזיוס עם קצב סיבוב של 2 פעמים G במשך 60 דקות.
ודא שברי הרקמה נמצאים בתנועה מתמדת במהלך תסיסה. ראשית, יוצקים 5 מיליליטר של מדיה הפרדה מבוססת סיליקה 66% לכל אחד מ-3 צינורות פוליפרופילן נפרדים של 15 מיליליטר. לאחר מכן, השתמש פיפטה סרולוגית 25 מיליליטר כדי לאסוף רק את supernatant מ קולאגנס Digestion 1.
סנן את העל-טבעי דרך מסננת תאי בד סינון ירודה של 40 מיקרוליטר שהונחה בתוך צינור חרוט פוליפרופילן נקי של 50 מיליליטר. ממלאים את הצינור לחלוטין עם חיץ המעי הגס צונן כדי להתרווה את חיץ העיכול קולגן. ואז לסובב את התאים, שאף את העל-טבעי, ושמור את גלולת הקרח על הקרח.
המשך לבצע עיכול קולגנס 2 כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר עיכול קולגנס 2 הושלמה, לשטוף את שברי הרקמה במרץ קדימה ואחורה בין הצינור מזרק 10 מיליליטר דרך מחט קצה קהה 18-מד. חזור על סומק זה לפחות 7-8 מעברים, ממשיך עד שברי רקמה ברוטו או debri גלויים.
לאחר מכן, להעביר את ההשעיה פירוק רקמות דרך 40 מיקרומטר סינון לקוי בד תא מסננת להציב לתוך צינור פוליפרופילן נקי 50 מיליליטר. ממלאים את הצינור לשפה עם חיץ המעי הגס מצונן כדי להתרווה על העיכול והצנטריפוגה ב 800 פעמים G ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. להשליך את supernatant באמצעות שאיפה ואקום ולמשוך את גלולה מושעה מחדש מ Collagenase Digestion 1 לצינור המתאים שלה.
לאחר מכן, להשעות כל גלולה ב 24 מיליליטר של 44%סיליקה מבוסס צפיפות הפרדה מדיה לכל המעי הגס. השתמשו בפיפסה סרולוגית של 10 מיליליטר כדי לשכב באיטיות 8 מיליליטר של מדיה זו על כל אחד מ-3 הצינורות המכילים מדיית הפרדה מבוססת סיליקה של 66%. בזהירות לאזן את הצינורות בתוך דליי צנטריפוגה באמצעות סולם משקל או איזון.
צנטריפוגה ב 859 פעמים G ב 20 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות ללא הפסקה. אפשר למוטות לבוא לנוח לפני הסרת צינורות, דואג לא לשבש את התאים בממשק הדרגתי. תחילה, דמיין את ממשק המילוי ההדרגתי ליד סימן 5 מיליליטר, שבו בדרך כלל קיימת רצועה לבנה בעובי 1-2 מיליליטר.
ואקום שאף והשליך את 7 המיליליטרים העליונים של המילוי ההדרגתי כדי לאפשר גישה קלה יותר של פיפטה לממשק. באמצעות יניקה ידנית רציפה ותנופת פרק כף יד מסתובבת יציבה, לאסוף את שכבת הממשק של תאים. לאסוף עד הממשק בין שני מעברי צבע ברור שביר ולהעביר את הממשק חדש 50 מיליליטר פוליפרופילן צינור חרוט.
לאחר מכן, הוסף חיץ FACS לאמבטיה זו עד ההשעיה הכוללת מגיעה 50 מיליליטר. צנטריפוגה ב 800 פעמים G ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. לאחר מכן, שאף את העל-טבעי באמצעות שאיפת ואקום והשהה מחדש את גלולת הכדור במיליליטר אחד של חיץ FACS.
ההליך המתואר בסרטון זה יכול לשמש לבידוד תאים חד-גרעיניים מהמעי הגס או, עם שינויים, מהמעי הדק. בנוסף, ניתוח ציטומטריה ונתונים מבוצע כדי להשוות את שברי לימפוציטים אפופוטוטיים ונמקים / מתים בעת שימוש או קולגנס E או D לבידוד, עם שלנו ללא טיפול DNAse 1. בעקבות Annexin 5 וכתמי צבע כחול מתים לתיקון על מתלים תא יחיד בעקבות כל בידוד, קולגנס E ללא DNAse הראה אחוז גבוה משמעותית של תאים חיים לאחר בידוד בהשוואה קולגנס D ללא DNAse.
גם בהשוואה לקולגנס עם DNAse. בנוסף, זיהינו תאים נמקיים באחוז חציוני של 41.0% בקבוצת קולגנס E לעומת 90.0% בקבוצת קולגנס D. 75.9% בקבוצת קולגנס E DNAse ו-80.3% בקבוצת קולגנס D DNAse.
ציטומטריית זרימה רב-פרימטרית מוחלת לאחר מכן על MNC המבודד מעכברי נמען CD45.2 Valve-C ביום 7 לאחר קבלת BMT או דגמי BMT אלוגניים או סינגניים. המספרים המוחלטים הממוצעים של תאי T חיוביים ו- CD8 חיוביים של תורם CD8 שחולצו מנקודתיים של נמען BMT מחושבים ומוושוים. אז זה יכול להיות חשוב לזהות ו / או לכמת אוכלוסיות נדירות של תאי החיסון במודלים עכבר כזה.
ערכות משנה נדירות, כולל תאים רגולטוריים T חיוביים FOX-P3 נגזרים תורמים מוערכים הן במודלים סינגניים והן במודלים של BMT אלוגניים ואלוגניים. באמצעות שיטה זו, ניתן לנתח אפילו קבוצות משנה נדירות, כגון רגולציית T המעי הגס הנגזרת על-ידי התורם, לאחר BMT. יש לציין כי קולגנס E פעיל ב 37 מעלות צלזיוס.
אז כל פתרונות קולגנס צריך להיות מחומם מראש לפעילות קולגן נאותה ומרווה ביסודיות כדי לסיים את הפעילות. פרוטוקול זה מאפשר מספר רב של תאים חד-גרעיניים שניתן להשתמש בהם לאפיון עוקב על ידי ציטומטריית פלר, טכניקות ביולוגיה מולקולרית, מיקרוסקופיה, תרבות ואתר של, בין היתר. פרוטוקול זה סיפק הערכה מהימנה של דלקת במעי הגס של עכברים ניסיוניים לעומת מבוקרים במודל השתלת מח עצם.
ובכך להקל על גילוי מנגנונים חיסוניים רגולטוריים חדשניים של סובלנות להשתלה. קולגנס מ Clostridium Istoliticum הוא רהוט כי יש לטפל עם טכניקות בטיחות במעבדה. זה מהווה סכנה בריאותית כאשר בשאיפה עלול לגרום לגירוי בעור ובעין.
