Микроскопия живых клеток позволяет исследователям изучать деления дрожжей ядерной динамики в митоз и мейоз в режиме реального времени. Сила этого метода происходит от изучения ядерных процессов в живых клетках в нормальных физиологических условиях, что устраняет необходимость токсичных фиксаторов и пятен. В этом методе рассматриваются вопросы, связанные со сроками использования белка, стабильностью и подвижностью, которые не могут быть подотменены генетическим или биомеханическим манипуляциям.
Очень важно обратить пристальное внимание на здоровье и пригодность клеток деления дрожжей перед визуализацией. Всегда изучите морфологию и характеристики роста, чтобы обеспечить согласованность результатов в ходе экспериментов. Этот протокол показывает относительно простой способ подготовки слайдов микроскопа, которые при правильной освоении могут повысить консистенцию и воспроизводимость длительной визуализации живых клеток.
Для того чтобы начать выбрать вверх вещество клетки от криогенной пластины пробуждения, Streak оно на плиты YES, и инкубировать их на 25 градусах Celsius или 32 градусах Celsius в зависимости от генотипа дрожжа для того чтобы wake up напряжения дрожжей расщепления от криогенного консервации. Затем используйте стерильную петлю, чтобы выбрать клетки из отдельных колоний в пробужденные штаммы дрожжей деления и привить их в пробирки, содержащие три миллилитров жидкой среды ДА. Поместите трубки в шейкер при 150 до 220 об/мин, чтобы расти при 25 или 32 градусах по Цельсию на ночь до позднего входа фазы с желаемой оптической плотности чтения от 0,7 до 1,0.
Перенесите 10 микролитров культуры на слайд микроскопа. Положите крышку и поместите его под микроскопом, чтобы проверить на наличие надлежащей морфологии клеток и питательное состояние. Чтобы создать слайд микроскопа для анализа митоза или мейоза сначала добавить два грамма агарозы в 500-миллилитровой колбе, содержащей 100 миллилитров либо минимальной среды плюс добавки для митоза или жидкой sporulating среды для мейоза.
Разогрейте раствор агарозы в микроволновой печи мощностью 60% в 10-секундных приращениях или поместите стакан в водяную баню 55 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Закружить решение для обеспечения эффективного плавления. Настройка двух слайдов микроскопа на держатель наконечник пипетки с верхней слайд опираясь на два стека лабораторной ленты на обоих концах в качестве поддержки решений крест формы.
Отрегулируйте расстояние между двумя слайдами до более чем двух миллиметров, чтобы сформировать толстую площадку в следующих шагах для длительного изображения. После охлаждения расплавленной агарозы в течение одной минуты при комнатной температуре, удалите верхнюю горку и используйте широкий кончик пипетки, чтобы обойтись от 50 до 100 микролитров на нижней слайде, чтобы сделать пятно. Прежде чем агароза остынет место верхней слайд на вершине для создания распространения площадку около одного и 1 / 2 до двух сантиметров в диаметре.
Оптимальная визуализация живых клеток имеет решающее значение для последующих этапов обработки данных. Убедитесь, что для устранения любых воздушных безделушек в расплавленной агарозы и создать тонкую площадку для изображений периодов более четырех часов. Для изучения митотических событий растут клетки из стартовых культур либо в жидкой EMM или PMG плюс добавки в одночасье.
Перенесите один миллилитр культуры в кювет и измерьте на спектрофотометре на длине волны 595 нанометров. Рост клеток считается фазой среднего журнала, когда оптическая плотность достигает 0,4. Затем центрифуга один миллилитр клеточной суспензии при 1, 375 раз г в течение одной минуты.
Удалите супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы в минимальной среде плюс добавки к окончательному объему 100 микролитров. Для изображения мейотических событий растут клетки из стартовых культур в минимальной среде плюс добавки в одночасье. Рост клеток считается фазой позднего входа, когда оптическая плотность на 595 нанометров составляет от 0,7 до одного.
Далее, из позднего журнала культур получить 500 микролитров каждого штамма типа мат, H отрицательный и H положительный, и объединить, чтобы сделать одну миллилитровую подвеску клеток. Центрифуга клетки на 1, 375 раз г в течение одной минуты. Удалите супернатант и повторно посовелите гранулы в один миллилитр жидкого экстракта мальтозы.
Повторите экстракт мальтозы мыть еще три раза, чтобы обеспечить эффективное удаление питательных веществ. После последнего экстракта мальтозы промыть повторно в течение одного миллилитра экстракта мальтозы и перенести смесь в 50-миллилитровую колбу, содержащую девять миллилитров экстракта мальтозы. Инкубация в течение 12-16 часов при 22-25 градусах Цельсия при минимальной скорости вращения от 50 до 100 об/мин.
Появление многих круглых сгустков дрожжей деления в результате обильной самофоккуляции указывает на эффективное спаривание. Затем возьмите одноми миллилитровый образец культуры спаривания и центрифуги в 1 375 раз г в течение одной минуты. Удалите 750 микролитров супернатанта и повторно посовелите клетки в оставшемся супернатанте.
Vortex энергично в течение пяти секунд, чтобы нарушить сгустки. Выдайте 20 микролитров митотической или мейотической клеточной подвески на 2%агарозной прокладке. Удалите излишки среды, инвертирование слайда и положить его на верхней части без ворса бумажное полотенце в течение двух-трех секунд.
Переверните слайд и аккуратно поместите стеклянную крышку на верхней части колодки, гарантируя, чтобы не генерировать пузырьки воздуха. Для создания ячейки монослой повернуть крышку по часовой стрелке с указательным пальцем для одного полного оборота для митозных клеток или два полных оборота для клеток мейоза. Убедитесь, что клеточное вещество рассеивается по всей агарозной площадке, позволяющей лучше разъенять одиночные клетки или asci.
С помощью небольшой деревянной палки обойтись расплавленного углеводородного герметика по краям крышки для уплотнения каждой агарозы площадку. После того, как агарозная площадка запечатана место его на стадии микроскопа. Включите температурную камеру и установите ее до нужной температуры.
Поместите тарелку с мокрым бумажным полотенцем в камеру для контроля влажности микроскопной системы. Пусть он equilibrate в течение 10 до 15 минут при соответствующих условиях изображения. Это позволяет любым оставшимся пузырькам воздуха рассеиваться и любые сдвиги агарозы в последнюю минуту происходят.
Используйте цель 40X, чтобы найти соответствующие поля зрения для изображения. Переключитесь на цель 60X, чтобы начать сбор данных. В программном обеспечении, которое контролирует функцию микроскопа, выберите наборы фильтров микроскопа, которые лучше всего соответствуют флюорофорам под наблюдением.
Отрегулируйте длины волн возбуждения, чтобы соответствовать используемым фторфорам, используйте самую низкую мощность возбуждения, которая производит последовательный сигнал, и используйте время экспозиции от четырех до восьми часов для генерации приемлемых, но поддающихся количественной оценке и воспроизводимых данных изображений. Соберите не менее шести очков времени приобретения каждый час. В программном обеспечении для сбора изображений выберите по крайней мере один канал флуоресценции, с которого можно получить данные и использовать запас, состоящий из 13 секций с интервалом 0,5 микрометра.
В программном обеспечении Фиджи загрузить deconvolved изображение, выбрав Функцию импортера Bio-Formats под плагины меню. В всплывающем окне Import Options выберите Hyperstack, режим цвета по умолчанию, проверьте Autoscale и нажмите кнопку OK. Убедитесь, что отображаемое окно имеет правильное количество флуоресцентных каналов и временных рамок путем прокрутки боком на соответствующих барах внизу.
Сохранить как файл Tiff, который не сжимает данные. Затем в меню Analyze используйте опцию Set Measurements для выбора различных параметров. Например: область, максимальное серое значение Min, интегрированная плотность, среднее серое значение, медиана, положение стека, периметр и метка дисплея.
Выберите цвет и нажмите на инструмент каналов. В всплывающем окне каналов проверяют цветной канал, для которого будет измеряться интенсивность или область. Выберите изображение, затем ввените и нажмите на 32-битный.
Выберите функции Регулировки и Порога в меню Изображения. Проверьте темную фоновую коробку, выберите метод по умолчанию и выберите Красный, чтобы наложить сигналы, представляющие интерес. Используйте инструмент палочки, чтобы выделить каждую структуру интереса и нажмите букву T на клавиатуре, чтобы добавить выбранную рентабельность инвестиций в всплывающее окно менеджера рентабельности инвестиций.
Затем откройте папку ROI на молнии, чтобы загрузить менеджера рентабельности инвестиций и нажмите на каждый идентификатор рентабельности инвестиций в левой боковой панели. Выберите Меру из меню Анализ и повторите эту команду на каждом идентификаторе рентабельности инвестиций для количественной оценки объектов, представляющих интерес во всех срезах стека изображений. Сохраните результаты в качестве файла CSV для статистического анализа.
В этом исследовании, если клетки голодают из-за ограничения питательных веществ или разрастание, они будут показывать избыток вакуолов и уменьшился размер клеток. Логаритмические клетки показывают активную репликацию ДНК и деление клеток, а также панъядерное выражение Tos4-GFP и разделение очагов Sad1-DsRed. Неспособность к спариванию, как в случае, когда клетки недостаточно голодают азота, будет препятствовать их ввода мейоза.
Показана пара клеток деления, проходящих кариогамию. Надежная флоккуляция суспензии брачных клеток увеличивает взаимодействие между клетками и, таким образом, указывает на успешное спаривание и эффективную мейотическую индукцию. Зиготические asci принимают различные формы, в том числе зигзагообразные и банановые формы клеток.
В митозе, как клетки переход от метафазы к телофазе, первое изменение включает в себя сокращение ядерного размера в метафазе, в то время как второй показывает расщепление ядра во время анафазы. Помимо совместного использования некоторой динамики сегрегации с митотических клеток, мейотические клетки обладают ядерными колебаниями во время гомологичной рекомбинации и дальнейшего сокращения нуклеозидов в конце анафазы II.It ответственность исследователей за обеспечение того, чтобы параметры эксперимента могут быть воспроизведены в ходе экспериментов, и что собранные данные подходят для анализа вниз по течению. Визуализация живых клеток позволила следователям детально изучить механику ядерного деления в митозе и мейозе.
По мере того как флуоресцентные метки и возможности микроскопа улучшают число и тип процессов, которые мы можем наблюдать, будут увеличиваться.
