يسمح المجهر الحي للخلايا للباحثين بدراسة الديناميكيات النووية للخميرة الانشطارية في الانقسام وmiiosis في الوقت الحقيقي. قوة هذه الطريقة تأتي من دراسة العمليات النووية في الخلايا الحية في ظل الظروف الفسيولوجية العادية التي تلغي الحاجة إلى تثبيتات سامة والبقع. تتناول هذه التقنية الأسئلة المتعلقة بتوقيت البروتين، والاستقرار، والتنقل التي قد لا تكون قابلة للتلاعب الجيني أو البيوميكانيكية.
من الأهمية بمكان أن تولي اهتماما وثيقا لصحة ولياقة خلايا الخميرة الانشطار قبل التصوير. دائماً فحص مورفولوجيا وخصائص النمو لضمان اتساق النتائج عبر التجارب. هذا البروتوكول يظهر طريقة بسيطة نسبيا لإعداد الشرائح المجهر أنه عندما يتقن بشكل صحيح يمكن أن تعزز الاتساق والتكرار من التصوير الخلية الحية لفترات طويلة.
للبدء في التقاط المادة الخلية من التبريد استيقظ لوحة، خط على لوحات نعم، واحتضان لهم في 25 درجة مئوية أو 32 درجة مئوية اعتمادا على نمط الجينوم الخميرة لإيقاظ سلالات الخميرة الانشطار من الحفاظ على المبرد. ثم استخدام حلقة معقمة لاختيار الخلايا من المستعمرات الفردية في سلالات الخميرة الانشطار awakened وتطعيمها في أنابيب الاختبار التي تحتوي على ثلاثة ملليلترات من وسيط السائل نعم. ضع الأنابيب في شاكر عند 150 إلى 220 دورة في الدقيقة لتنمو عند 25 أو 32 درجة مئوية بين عشية وضحاها إلى مرحلة التسجيل المتأخر مع قراءة الكثافة البصرية المرغوبة من 0.7 إلى 1.0.
نقل 10 ميكرولترات من الثقافة إلى شريحة المجهر. وضع غطاء على ووضعه تحت المجهر للتحقق من مورفولوجيا الخلايا السليمة وحالة التغذية. لإعداد شريحة المجهر لتحليل الانقسام أو الانقسام أو أول إضافة غرامين من agarose في قارورة 500 ملليلتر تحتوي على 100 ملليلتر من إما الحد الأدنى من المتوسط بالإضافة إلى ملاحق ل mitosis أو وسيط sporulating السائل لداء الزفير.
سخني محلول agarose في فرن ميكروويف بنسبة 60٪ بزيادات 10 ثوان أو ضع القارس في حمام مائي 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. دوامة الحل لضمان ذوبان فعالة. قم بإعداد إثنين من شرائح المجهر على حامل رأس ماص مع الشريحة العلوية التي تقع على رصتين من شريط المختبر في كلا الطرفين كدعم لصنع شكل متقاطع.
اضبط المسافة بين الشرائح إلى أكثر من مليمترين حتى تكوّن لوحة سميكة في الخطوات التالية للتصوير المطول. بعد تبريد agarose المنصهر لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وإزالة الشريحة العلوية واستخدام طرف ماصة تتحمل واسعة للاستغناء عن 50 إلى 100 ميكروليترس على الشريحة السفلي لجعل بقعة. قبل أن يبرد agarose وضع الشريحة العليا على القمة لتوليد منصة انتشار من حوالي واحد و 1/2 إلى اثنين من سنتيمتر في القطر.
التصوير الأمثل للخلايا الحية أمر بالغ الأهمية بالنسبة لخطوات معالجة البيانات اللاحقة. تأكد من القضاء على أي من الحلي الهوائية في agarose المنصهرة وإنشاء لوحة رقيقة لفترات التصوير أطول من أربع ساعات. لفحص الأحداث الميتوتك تنمو الخلايا من الثقافات بداية في إما EMM السائل أو PMG بالإضافة إلى ملاحق بين عشية وضحاها.
نقل ملليلتر واحد من الثقافة إلى cuvette، وقياس على مقياس الطيفي في الطول الموجي من 595 نانومتر. ويعتبر نمو الخلية منتصف مرحلة السجل عندما تصل الكثافة البصرية 0.4. ثم جهاز طرد مركزي ملليلتر واحد من تعليق الخلية في 1، 375 مرات ز لمدة دقيقة واحدة.
إزالة عظمى و resuspend بيليه الخلية في الحد الأدنى المتوسطة بالإضافة إلى ملاحق إلى حجم النهائي من 100 ميكرولترات. لصورة الأحداث meiotic تنمو الخلايا من الثقافات بداية في الحد الأدنى من المتوسطة بالإضافة إلى ملاحق بين عشية وضحاها. ويعتبر نمو الخلايا مرحلة تسجيل متأخرة عندما تكون الكثافة البصرية عند 595 نانومتر بين 0.7 و 1.
بعد ذلك ، من الثقافات سجل في وقت متأخر الحصول على 500 microliters من كل سلالة نوع ميت ، H السلبية وH إيجابية ، والجمع بين لجعل تعليق خلية ملليلتر واحد. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 1، 375 مرات ز لمدة دقيقة واحدة. إزالة افرنح و resuspend بيليه في ملليلتر واحد من استخراج مالتوس السائل.
كرر غسل استخراج المالتوز ثلاث مرات أخرى لضمان إزالة المغذيات فعالة. بعد آخر استخراج maltose غسل resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من استخراج مالتوس ونقل الخليط إلى قارورة 50 ملليلتر تحتوي على تسعة ملليلتر من استخراج المالتوز. احتضان لمدة 12 إلى 16 ساعة في 22 إلى 25 درجة مئوية على سرعة دوران الحد الأدنى بين 50 و 100 دورة في الدقيقة.
ظهور العديد من كتل الخميرة الانشطار جولة الناتجة عن وفرة الذاتي flocculation يشير إلى التزاوج كفاءة. بعد ذلك، خذ عينة من ميلليلتر واحد من ثقافة التزاوج والطرد المركزي في 1، 375 مرة ز لمدة دقيقة واحدة. إزالة 750 ميكرولترات من السوبر و resuspend الخلايا في ناظر المتبقية.
دوامة بقوة لمدة خمس ثوان لتعطيل كتل. الاستغناء 20 ميكرولترات إما تعليق الخلية الميتة أو meiotic على وسادة agarose 2٪. إزالة أي وسيلة زائدة عن طريق عكس الشريحة ووضعها على الجزء العلوي من منشفة ورقية خالية من الوبر لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان.
اقلب الشريحة وضع غطاء زجاجي بلطف على الجزء العلوي من اللوحة، مما يضمن عدم توليد فقاعات الهواء. لإنشاء خلية أحادية الطبقات تدوير غطاء في اتجاه عقارب الساعة مع السبابة لواحدة بدوره الكامل لخلايا الانقسام أو اثنين من المنعطفات الكاملة لخلايا ميوز. تأكد من أن المادة الخلية يتفرق عبر لوحة agarose السماح لفصل أفضل من الخلايا المفردة أو asci.
مع المعونة من عصا خشبية صغيرة الاستغناء عن تسرب الهيدروكربون المنصهر على طول حواف الغطاء لختم كل وسادة agarose. مرة واحدة يتم ختم لوحة agarose وضعه على مرحلة المجهر. التبديل على غرفة درجة الحرارة وتعيينه إلى درجة الحرارة المطلوبة.
وضع لوحة مع منشفة ورقية مبللة في الغرفة للسيطرة على الرطوبة من نظام المجهر. اتركه اِهزِم لمدة 10 إلى 15 دقيقة في ظروف التصوير المناسبة. وهذا يسمح لأي فقاعات الهواء المتبقية لتبديد وأي التحولات agarose في اللحظة الأخيرة أن يحدث.
استخدم الهدف 40X للعثور على حقول الرؤية المناسبة للصورة. قم بالتبديل إلى الهدف 60X لبدء الحصول على البيانات. في البرنامج الذي يتحكم وظيفة المجهر اختيار مجموعات مرشح المجهر التي تطابق أفضل الفلوروفوريس تحت المراقبة.
ضبط الأطوال الموجية الإثارة لتتناسب مع الفلوروفورات المستخدمة، واستخدام أدنى قوة الإثارة التي تنتج إشارة متسقة، واستخدام أوقات التعرض من أربع إلى ثماني ساعات لتوليد بيانات التصوير مقبولة ولكن قابلة للقياس الكمي وقابلة للتكرار. جمع ما لا يقل عن ست نقاط وقت الاكتساب كل ساعة. في برنامج جمع الصور اختيار قناة واحدة على الأقل fluorescence من خلالها للحصول على البيانات وتوظيف Z- الأسهم تتألف من 13 قسما مع 0.5 ميكرومتر التباعد.
في فيجي تحميل البرمجيات صورة deconvolved عن طريق تحديد ميزة Bio-Formats Importer ضمن القائمة المكونات الإضافية. في النافذة المنبثقة خيارات الاستيراد، حدد Hyperstack، وضع اللون الافتراضي، تحقق من المقياس التلقائي واضغط على الزر موافق. تأكد من أن النافذة المعروضة تحتوي على العدد الصحيح من قنوات الفلوريسنس والأُطر الزمنية عن طريق التمرير الجانبي على القضبان ذات الصلة في الأسفل.
حفظ كملف Tiff الذي لا ضغط البيانات. ثم تحت القائمة تحليل استخدام خيار تعيين القياسات لاختيار معلمات مختلفة. على سبيل المثال: المساحة، الحد الأدنى من قيمة الرمادي الأقصى، الكثافة المتكاملة، متوسط قيمة الرمادي، متوسط، موضع المكدس، محيط، وتسمية العرض.
حدد اللون وانقر على أداة القنوات. في نافذة القنوات المنبثقة تحقق من قناة اللون التي سيتم قياس شدتها أو المنطقة الخاصة بها. حدد صورة، ثم اكتب وانقر على 32 بت.
اختر ميزات الضبط والعتبة ضمن قائمة الصورة. حدد مربع الخلفية الداكنة، وحدد الطريقة الافتراضية، ثم اختر الأحمر لتتراكب إشارات الاهتمام. استخدم أداة العصا لتمييز كل بنية ذات أهمية واضغط على الحرف T على لوحة المفاتيح لإضافة عائد الاستثمار المحدد إلى نافذة مدير عائد الاستثمار المنبثقة.
بعد ذلك، افتح مجلد ROI المضغوط لتحميل مدير عائد الاستثمار وانقر على كل معرف عائد الاستثمار في اللوحة الجانبية اليمنى. حدد قياس من القائمة تحليل وكرر هذا الأمر على كل معرف عائد الاستثمار لتحديد الكائنات ذات الأهمية في جميع شرائح كومة الصور. حفظ النتائج كملف CSV للتحليل الإحصائي.
في هذه الدراسة إذا الخلايا تجويع بسبب نقص المغذيات أو فرط النمو، فإنها تظهر vacuoles الزائدة وانخفاض حجم الخلية. تظهر الخلايا اللوغاريتمية تكرار الحمض النووي النشط وتقسيم الخلايا، وكذلك التعبير النووي Tos4-GFP وفصل ساد1-DsRed. الفشل في التزاوج ، كما هو الحال عندما لا تكون الخلايا جائعة بما فيه الكفاية من النيتروجين ، سيمنعها من دخول الداء الوسيم.
يظهر زوج من الخلايا الانشطارية التي تخضع للكاروغامي. و يعزز التزاوج القوي لتعليق خلايا التزاوج التفاعل بين خلية وخلية، وبالتالي يشير إلى نجاح التزاوج والحث الويني الفعال. Zygotic asci اتخاذ أشكال متعددة، بما في ذلك الأشكال الخلوية متعرج والموز.
في الانقسام مع انتقال الخلايا من ميتافاتاز إلى التيلواز، ينطوي التغيير الأول على انكماش الحجم النووي في ميتافالوز، في حين يظهر الثاني انقسام النواة أثناء الphase. وإلى جانب مشاركة بعض ديناميات الفصل مع الخلايا الميتوطية، تظهر الخلايا النانوية تذبذباً نووياً أثناء إعادة التركيب المتماثلة المتجانسة، والمزيد من الحد من النيوكليوسيدات في نهاية II.It الphase هي مسؤولية الباحثين لضمان إمكانية استنساخ بارامترات التجربة عبر التجارب، وأن البيانات التي تم جمعها صالحة للتحليل في المصب. وقد سمح التصوير الحي للخلايا للمحققين بفحص دقيق لميكانيكا الانقسام النووي في الانقسام الانقسامي وداء اليونيوس.
كما العلامات الفلورسنت وقدرات المجهر تحسين عدد ونوع العمليات التي يمكن أن نلاحظ زيادة.
