살아있는 세포 현미경 검사는 연구원이 실시간으로 미토시스와 메이오시스에 있는 핵분열 효모 핵 역학을 연구할 수 있습니다. 이 방법의 강도는 독성 고정제와 얼룩에 대한 필요성을 제거하는 정상적인 생리 적 조건하에서 살아있는 세포에서 핵 프로세스를 연구에서 온다. 이 기술은 유전적 또는 생체 역학적 조작에 만전을 기하지 못할 수 있는 단백질 타이밍, 안정성 및 이동성과 관련된 질문을 다룹니다.
이미징 전에 핵분열 효모 세포의 건강과 적합성에 세심한 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 항상 형태와 성장 특성을 검사하여 실험 전반에 걸쳐 결과의 일관성을 보장합니다. 이 프로토콜은 현미경 슬라이드를 올바르게 마스터할 때 장기간 된 라이브 세포 이미징의 일관성과 재현성을 향상시킬 수있는 비교적 간단한 방법을 보여줍니다.
극저온 웨이크 업 플레이트에서 세포 물질을 집어 들기 시작하려면 YES 플레이트에 적시고 효모 유전자형에 따라 섭씨 25도 또는 섭씨 32도에서 배양하여 극저온 보존에서 핵분열 효모 균주를 깨우세요. 그런 다음 멸균 루프를 사용하여 각성 된 핵 분열 효모 균주에서 개별 식민지에서 세포를 선택하고 YES 액체 배지의 3 밀리리터를 포함하는 시험 관으로 접종하십시오. 튜브를 150~220rpm에 셰이커에 배치하여 밤새 섭씨 25도 또는 32도에서 늦은 로그 단계까지 0.7~1.0의 원하는 광학 밀도 판독값을 제공합니다.
배양의 마이크로리터 10편을 현미경 슬라이드로 옮기다. 커버슬립을 착용하고 현미경으로 배치하여 적절한 세포 형태와 영양 상태를 확인합니다. 미토시스 또는 메이오시스 분석을 위한 현미경 슬라이드를 설치하려면 먼저 미토시스용 미토시스 또는 액체 포자화 매체에 대한 최소 배지 100 밀리리터와 보충제를 함유한 500 밀리리터 플라스크에 아가로즈 2그램을 추가합니다.
아가로즈 용액을 전자레인지에 60%의 전력으로 10초 단위로 데우거나 비커를 섭씨 55도의 수조에 10분간 놓습니다. 효율적인 용융을 보장하기 위해 솔루션을 소용돌이. 파이펫 팁 홀더에 두 개의 현미경 슬라이드를 설정하여 상단 슬라이드가 양쪽 끝에 있는 두 개의 실험실 테이프 스택에 놓아 크로스 모양을 만드는 것을 지원합니다.
두 슬라이드 사이의 거리를 2밀리미터 이상으로 조정하여 장기간 이미징을 위해 다음 단계에서 두꺼운 패드를 형성합니다. 실온에서 1분 동안 용융 아가로즈를 냉각한 후 상단 슬라이드를 제거하고 넓은 보어 파이펫 팁을 사용하여 하단 슬라이드에 50~100마이크로리터를 분배하여 자리를 만듭니다. 아가로즈가 식히기 전에 상단 슬라이드를 위에 놓고 직경이 약 1및 1/2 ~ 2cm의 스프레드 패드를 생성합니다.
최적의 라이브 셀 이미징은 후속 데이터 처리 단계에 매우 중요합니다. 용융 아가로즈의 공기 장식을 제거하고 4시간 이상 이미징 기간을 위한 얇은 패드를 만들어야 합니다. 미토틱 이벤트를 검사하려면 액체 EMM 또는 PMG 플러스 하룻밤 보충에서 스타터 배양에서 세포를 성장.
배양물의 1밀리리터를 큐벳으로 옮기고, 595나노미터의 파장에서 분광계계를 측정한다. 세포 성장은 광학 밀도가 0.4에 도달하면 중간 로그 단계로 간주됩니다. 그런 다음 1 분 동안 1, 375 배 g에서 세포 현탁액의 원심 분리기 1 밀리리터.
상체를 제거하고 최소 배지플러스 보충제로 셀 펠릿을 100 마이크로리터의 최종 부피에 재보아보세요. 이미지 meiotic 이벤트 최소한의 매체 플러스 하룻밤 보충에 스타터 배양에서 세포를 성장. 세포 성장은 595 나노미터의 광학 밀도가 0.7에서 1 사이일 때 후기 로그 단계로 간주됩니다.
다음으로, 후기 로그 배양에서 각 메이트 타입 스트레인, H 네거티브 및 H 양성의 500 마이크로리터를 획득하고 결합하여 1밀리리터 셀 서스펜션을 만듭니다. 1 분 동안 1, 375 배 g에서 세포를 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 액체 말토제 추출물의 1 밀리리터에 펠릿을 다시 분리합니다.
효율적인 영양소 제거를 위해 말토세 추출물을 3회 더 세척합니다. 마지막 말토세 추출물 세척 후 말토세 추출물의 1 밀리리터로 세포를 재연하고 9밀리리터의 말토세 추출물을 함유한 50밀리리터 플라스크로 혼합물을 옮겨낸다. 50~100rpm 사이의 최소 회전 속도로 섭씨 22~25도에서 12~16시간 동안 배양합니다.
풍부한 자기 플로칭으로 인한 많은 둥근 핵분열 효모 덩어리의 출현은 효율적인 짝짓기임을 나타냅니다. 다음으로 짝짓기 배양과 원심분리기의 1밀리리터 샘플을 1분 동안 1, 375배 g로 채취하십시오. 750마이크로리터의 상류체를 제거하고 나머지 상수체의 세포를 다시 분리합니다.
소용돌이는 덩어리를 방해하기 위해 5 초 동안 적극적으로. 2%아가로즈 패드에 미토틱 또는 메이오틱 셀 서스펜션의 20 마이크로리터를 분배합니다. 슬라이드를 반전시키고 2~3초 동안 보풀이 없는 종이 타월 위에 올려 놓고 여분의 매체를 제거합니다.
슬라이드를 뒤집고 패드 상단에 유리 커버슬립을 부드럽게 놓아 기포를 생성하지 않도록 합니다. 세포 단층은 미토시스 세포 또는 메이오시스 세포에 대한 두 개의 전체 회전에 대한 검지 손가락으로 시계 방향으로 커버 슬립을 회전합니다. 세포 물질이 아가로즈 패드를 가로질러 분산되어 단일 세포 또는 아시의 더 나은 분리를 허용합니다.
작은 나무 막대기의 도움으로 각 아가로즈 패드를 밀봉커버슬립의 가장자리를 따라 용융 탄화수소 실란트를 분배합니다. 아가로즈 패드가 밀봉되면 현미경 단계에 놓습니다. 온도 챔버를 켜고 원하는 온도로 설정합니다.
젖은 종이 타월이있는 접시를 챔버에 놓고 현미경 시스템의 습도를 제어하십시오. 적절한 이미징 조건에서 10~15분 동안 평형화할 수 있습니다. 이렇게 하면 남은 기포가 사라지고 막판아가로스 가시가 발생할 수 있습니다.
40X 목표를 사용하여 이미지에 적합한 보기 필드를 찾습니다. 데이터 수집을 시작하기 위해 60X 목표로 전환합니다. 현미경 기능을 제어하는 소프트웨어에서 관찰 중인 형광과 가장 잘 일치하는 현미경 필터 세트를 선택합니다.
사용되는 형광에 맞게 흥분 파장을 조정하고, 일관된 신호를 생성하는 가장 낮은 흥분 력을 사용하고, 4~8시간의 노출 시간을 사용하여 허용 가능하면서도 정량화 가능하고 재현 가능한 이미징 데이터를 생성합니다. 매시간 최소 6회 획득 시간 포인트를 수집합니다. 이미지 컬렉션 소프트웨어에서 데이터를 수집하고 0.5 마이크로미터 간격이 있는 13개의 섹션으로 구성된 Z 스톡을 사용하는 하나 이상의 형광 채널을 선택합니다.
피지 소프트웨어플러그인 메뉴에서 바이오 포맷 수입 기능을 선택하여 절제된 이미지를 업로드합니다. 가져오기 옵션 팝업 창에서 하이퍼스택, 기본 색상 모드를 선택하고 자동 배율을 확인하고 확인 버튼을 누릅니다. 표시된 창에 하단의 각 막대에서 옆으로 스크롤하여 형광 채널과 시간 프레임의 정확한 수가 있는지 확인합니다.
데이터를 압축하지 않는 Tiff 파일로 저장합니다. 그런 다음 분석 메뉴에서 측정 설정 옵션을 사용하여 다양한 매개 변수를 선택합니다. 예: 영역, 최소 최대 회색 값, 통합 밀도, 평균 회색 값, 중앙값, 스택 위치, 둘레 및 표시 레이블입니다.
색상을 선택하고 채널 도구를 클릭합니다. 채널 팝업 창에서 강도 또는 영역이 측정되는 컬러 채널을 확인합니다. 이미지를 선택한 다음 32비트를 입력하고 클릭합니다.
이미지 메뉴에서 조정 및 임계값 피쳐를 선택합니다. 어두운 배경 상자를 선택하고 기본 메서드를 선택하고 빨간색을 선택하여 관심 있는 신호를 오버레이합니다. 지팡이 도구를 사용하여 관심 있는 각 구조를 강조하고 키보드의 문자 T를 눌러 선택한 ROI를 팝업 ROI 관리자 창에 추가합니다.
다음으로 지퍼된 ROI 폴더를 열어 ROI 관리자를 로드하고 왼쪽 패널의 각 ROI 식별자를 클릭합니다. 분석 메뉴에서 측정값을 선택하고 각 ROI 식별자에서 이 명령을 반복하여 이미지 스택의 모든 조각에 대한 관심 있는 개체를 정량화합니다. 결과를 통계 분석을 위한 CSV 파일로 저장합니다.
이 연구에서 는 세포 영양소 제한 또는 과성장으로 인해 굶주린 경우, 그들은 과잉 vacuoles 및 감소 된 세포 크기를 보여줄 것 이다. 로개반스믹 세포는 활성 DNA 복제 및 세포 분열뿐만 아니라 범핵 Tos4-GFP 발현 및 Sad1-DsRed foci 분리를 보여줍니다. 세포가 질소의 충분히 굶주리지 않는 경우와 같이 짝짓기를 하지 못하면 메이오증에 들어가는 것을 방지할 수 있습니다.
카요가미를 받는 핵분열 세포 한 쌍이 표시됩니다. 결합 세포 현탁액의 견고한 flocculation는 세포 대 세포 상호 작용을 증가시키고 따라서 성공적인 결합 및 효율적인 메이오틱 유도를 나타냅니다. Zygotic asci는 지그재그와 바나나 세포 모양을 포함하여 여러 형태를 취합니다.
세포가 메타상에서 텔로상으로 전환함에 따라 미토시스에서, 첫 번째 변화는 메타단계에서 핵 크기의 수축을 수반하고, 두 번째 변화는 해부학 중에 핵 분할을 나타낸다. 미토세포와 일부 분리 역학을 공유하는 것 외에도, 메이오틱 세포는 상형 재조합 중 핵 진동을 나타내고 해부학 II.It 끝에 핵세포의 추가 감소는 실험 파라미터를 실험 전반에 걸쳐 재현할 수 있고, 수집된 데이터가 다운스트림 분석에 적합하다는 것을 보장하기 위한 연구자의 책임입니다. 살아있는 세포 화상 진찰은 조사자가 미토시스와 meiosis에 있는 핵 분열의 역학을 면밀히 검토할 수 있었습니다.
형광 태그와 현미경 기능이 개선됨에 따라 관찰 할 수있는 프로세스의 수와 유형이 증가 할 것입니다.
