מיקרוסקופיה של תאים חיים מאפשרת לחוקרים לחקור דינמיקה גרעינית של שמרי ביטוזה ומיוזיס בזמן אמת. כוחה של שיטה זו מגיע מלימוד תהליכים גרעיניים בתאים חיים בתנאים פיזיולוגיים רגילים אשר מבטל את הצורך fixatives רעילים וכתמים. טכניקה זו מטפלת בשאלות הקשורות לתזמון חלבון, יציבות וניידות שאינן זמינות למניפולציה גנטית או ביומכנית.
זה קריטי לשים לב לבריאות וכושר של תאי שמרים ביבוע לפני הדמיה. בדוק תמיד מורפולוגיה ומאפייני צמיחה כדי להבטיח עקביות של תוצאות על פני ניסויים. פרוטוקול זה מציג את הדרך הפשוטה יחסית להכין שקופיות מיקרוסקופ שכאשר שולטים כראוי יכול לשפר את העקביות ואת הרבייה של דימות תאים חיים ממושך.
כדי להתחיל לאסוף חומר תאים מצלחת ההתעוררות הקריוגנית, תפסו אותו על צלחות YES, והדוגר אותם ב-25 מעלות צלזיוס או 32 מעלות צלזיוס בהתאם לגנוטיפ השמרים כדי להעיר זני שמרי ביקוע משיימור קריוגני. לאחר מכן השתמש בלולאה סטרילית כדי לאסוף תאים מהמושבות הבודדות בזני שמרי הבניקון המתעוררים ולחסן אותם במבחנות המכילות שלושה מיליליטר של מדיום נוזלי של YES. מניחים את הצינורות בשייקר ב 150 עד 220 סל"ד לגדול ב 25 או 32 מעלות צלזיוס לילה לשלב יומן מאוחר עם קריאה בצפיפות אופטית הרצויה של 0.7 עד 1.0.
העבר 10 מיקרוליטרים של התרבות לשקופית מיקרוסקופ. שים כיסוי על ולהניח אותו תחת מיקרוסקופ כדי לבדוק מורפולוגיה התא הנכון מצב תזונתי. כדי להקים שקופית מיקרוסקופ עבור מיטוזה או ניתוח meiosis הראשון להוסיף שני גרם של אגרוז בבקבוק 500 מיליליטר המכיל 100 מיליליטר של או בינוני מינימלי בתוספת תוספי תזונה עבור מיטוזה או נוזלי sporulating בינוני עבור meiosis.
מחממים את תסנו ה-Agarose בתנור מיקרוגל בהפקת חשמל של 60% במרווחים של 10 שניות או מניחים את המקם באמבט מים של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. סובב את הפתרון כדי להבטיח התכה יעילה. הגדר שתי שקופיות מיקרוסקופ על מחזיק קצה פיפטה כאשר השקופית העליונה מונחת על שתי ערימות של סרט מעבדה בשני הקצוות כתמיכה בהכנת צורת צלב.
התאם את המרחק בין שתי השקופיות ליותר משני מילימטרים כדי ליצור משטח עבה בשלבים הבאים להדמיה ממושכת. לאחר קירור agarose מותך במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, להסיר את השקופית העליונה ולהשתמש טיפ פיפטה משעמם רחב לוותר 50 עד 100 microliters על השקופית התחתונה כדי להפוך את נקודה. לפני התעוררות מתקרר למקם את השקופית העליונה על גבי כדי ליצור כרית התפשטות של כאחד ו 1/2 כדי שני סנטימטרים קוטר.
דימות תאים חיים אופטימלי הוא קריטי עבור שלבי עיבוד הנתונים הבאים. הקפד לחסל את כל קישוטי אוויר אגרוז מותך וליצור כרית דקה לתקופות הדמיה יותר מארבע שעות. כדי לבחון אירועים מיוטיים לגדל תאים מתרבויות המתנע ב EMM נוזלי או PMG בתוספת תוספי מזון לילה.
מעבירים מיליליטר אחד של התרבות לקובט, ומודדים על הספקטרופוטומטר באורך גל של 595 ננומטר. צמיחת התא נחשבת שלב באמצע יומן כאשר הצפיפות האופטית מגיעה 0.4. ואז צנטריפוגה מיליליטר אחד של ההשעיה התא ב 1, 375 פעמים g לדקה אחת.
הסר את supernatant ו resuspend גלולת התא בינוני מינימלי בתוספת תוספי תזונה לנפח הסופי של 100 microliters. כדי תמונה אירועים meiotic לגדול תאים מתרבויות המתנע בינוני מינימלי בתוספת תוספי מזון בן לילה. צמיחת תאים נחשבת שלב יומן מאוחר כאשר הצפיפות האופטית ב 595 ננומטר הוא בין 0.7 ואחד.
לאחר מכן, מתרבויות יומן מאוחר להשיג 500 microliters של כל סוג חבר זן, H שלילי ו H חיובי, ולשלב כדי להפוך את השעיית תא מיליליטר אחד. צנטריפוגה התאים ב 1, 375 פעמים גרם לדקה אחת. הסר את supernatant ו resuspend את גלולה במיליליטר אחד של תמצית מלטוז נוזלי.
חזור על תמצית מלטוז לשטוף שלוש פעמים נוספות כדי להבטיח הסרת חומרים מזינים יעילה. לאחר תמצית מלטוז האחרונה לשטוף resuspend התאים במיליליטר אחד של תמצית מלטוז ולהעביר את התערובת לבקבוק 50 מיליליטר המכיל תשעה מיליליטר של תמצית מלטוז. דגירה במשך 12 עד 16 שעות ב 22 עד 25 מעלות צלזיוס במהירות סיבוב מינימלית בין 50 ל 100 סל"ד.
המראה של גושי שמרי ביקוע עגולים רבים הנובעים משפע של תדלוק עצמי מצביע על הזדווגות יעילה. לאחר מכן, קח דגימה של מיליליטר של תרבות ההזדווגות והצנטריפוגה ב 1, 375 פעמים g לדקה אחת. הסר 750 מיקרוליטרים של העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים בשארית העל-טבעית.
וורטקס במרץ במשך חמש שניות כדי לשבש את הגושים. לוותר על 20 מיקרוליטרים של מתלה תאים מיוטי או מיוטי על כרית של 2%. הסר כל מדיום עודף על ידי היפוך השקופית ולשים אותו על החלק העליון של מגבת נייר ללא מוך במשך שתיים עד שלוש שניות.
הפוך את השקופית והצב בעדינות כיסוי זכוכית על החלק העליון של הפנקס, כדי להבטיח שלא ליצור בועות אוויר. כדי ליצור monolayer התא לסובב את coverslip בכיוון השעון עם האצבע המורה עבור סיבוב אחד מלא עבור תאים מיטוזה או שני סיבובים מלאים עבור תאי meiosis. ודא כי החומר התא מתפזר על פני כרית אגרוז המאפשר הפרדה טובה יותר של תאים בודדים או asci.
בעזרת מקל עץ קטן לוותר על איטום פחמימנים מותך לאורך הקצוות של כיסוי לאטום כל כרית אגרוז. לאחר כרית אגרוז אטום למקם אותו על שלב מיקרוסקופ. הפעל את תא הטמפרטורה והגדר אותו לטמפרטורה הרצויה.
מניחים צלחת עם מגבת נייר רטובה לתוך התא כדי לשלוט בלחות של מערכת המיקרוסקופ. תן לו לצייד במשך 10 עד 15 דקות בתנאי ההדמיה המתאימים. זה מאפשר לכל בועות האוויר הנותרות להתפוגג וכל שינוי של הרגע האחרון התעורר להתרחש.
השתמש במטרה 40X כדי למצוא שדות תצוגה מתאימים לתמונה. עבור למטרה 60X כדי להתחיל ברכישת נתונים. בתוכנה השולטת בתפקוד המיקרוסקופ, בחר את ערכות מסנן המיקרוסקופ התואמות בצורה הטובה ביותר לפליאורופורים תחת השגחה.
התאימו את אורכי הגל של העירור כך שיתאימו לפלאורופורים שבהם נעשה שימוש, השתמשו בכוח העירור הנמוך ביותר שמייצר אות עקבי, והשתמשו בזמני חשיפה של ארבע עד שמונה שעות כדי ליצור נתוני הדמיה מקובלים אך ניתנים לכימות ושחזור. לאסוף לפחות שש נקודות זמן רכישה בכל שעה. בתוכנת איסוף התמונות בחרו לפחות ערוץ פלואורסצנטי אחד שממנו ניתן לרכוש נתונים ומעסיקים מלאי Z המורכב מ-13 מקטעים עם מרווח של 0.5 מיקרומטר.
בתוכנת פיג'י להעלות תמונה deconvolved על ידי בחירת התכונה ביו-פורמטים יבואן תחת תפריט תוספים. בחלון הנפתח 'אפשרויות ייבוא', בחרו 'היפרסטאק', 'מצב צבע ברירת מחדל', בדקו את האפשרות 'שינוי גודל אוטומטי' וחצו על הלחצן 'אשר'. ודא שלחלון המוצג יש את המספר הנכון של ערוצי פלואורסצנטיות ומסגרות זמן על-ידי גלילה לצדדים על הסורגים המתאימים בתחתית.
שמור כקובץ Tiff שאינו דוחס נתונים. לאחר מכן, בתפריט 'ניתוח', השתמשו באפשרות 'קבע מידות' לבחירת פרמטרים שונים. לדוגמה:שטח, ערך אפור מרבי דק, דחיסות משולבת, ערך אפור ממוצע, חציון, מיקום מחסנית, היקף ותווית תצוגה.
בחרו 'צבע' ולחצו על הכלי ערוצים. בחלון הנפתח Channels בדקו את ערוץ הצבע עבורו יימדדו העוצמה או האזור. בחר תמונה ולאחר מכן הקלד ולחץ על 32 סיביות.
בחרו בתכונות 'התאם' ו'סף' מתפריט 'תמונה'. סמן את התיבה רקע כהה, בחר את שיטת ברירת המחדל ובחר אדום כדי שכבת-על של אותות העניין. השתמש בכלי השרביט כדי לסמן כל מבנה מעניין ולחץ על האות T בלוח המקשים כדי להוסיף את ההשקעה שנבחרה לחלון מנהל ההשקעות המוקפץ.
לאחר מכן, פתח את תיקיית ROI מכווצת כדי לטעון את מנהל ROI ולחץ על כל מזהה ROI בלוח בצד שמאל. בחרו 'מדוד' מתפריט 'נתח' וחזרו על פקודה זו בכל מזהה ROI כדי לכמת את האובייקטים המעניינים בכל פרוסות מחסנית התמונות. שמור את התוצאות כקובץ CSV לניתוח סטטיסטי.
במחקר זה אם תאים גוועים ברעב עקב הגבלה תזונתיים או יתר על כן, הם יראה vacuoles עודף וגודל תאים מופחת. תאים לוגריתמיים מראים שכפול DNA פעיל וחלוקת תאים, כמו גם ביטוי Tos4-GFP פאן-גרעיני והפרדת מוקדים Sad1-DsRed. כישלון להזדווג, כמו במקרה של תאים אינם מורעבים מספיק של חנקן, ימנע מהם להיכנס meiosis.
זוג תאי בוקיום העוברים קריוגמיה מוצגים. פלוקלציה חזקה של המתלים מתא ההזדווגות מגבירה את האינטראקציה בין התא לתא ובכך מצביעה על הזדווגות מוצלחת ועל אינדוקציה מיוטית יעילה. Zygotic asci לקחת צורות מרובות, כולל צורות זיג זג ותא בננה.
במיטוזיס כמו תאים לעבור ממטאפאז לטלופאז, השינוי הראשון כרוך התכווצות של גודל גרעיני במטאפאזה, ואילו השני מראה פיצול גרעין במהלך אנאפס. מלבד שיתוף כמה דינמיקות הפרדה עם תאים mitotic, תאים meiotic להפגין תנודות גרעיניות במהלך recombination הומולוגי הפחתה נוספת של נוקלאוזידים בסוף anaphase II.It היא באחריות החוקרים כדי להבטיח כי פרמטרים הניסוי ניתן לשכפל על פני ניסויים, כי הנתונים שנאספו מתאים לניתוח במורד הזרם. הדמיית תאים חיים אפשרה לחוקרים לבחון בפירוט רב את המכניקה של החטיבה הגרעינית במיטוזיס ומיוזיס.
ככל שתגי פלואורסצנטיים ויכולות מיקרוסקופ ישפרו את מספר וסוג התהליכים שאנו יכולים לצפות בהם יגדלו.
