Как аксоны ориентируются в сложной матрице центральной нервной системы, является фундаментальным вопросом в нейробиологии. Этот протокол позволяет изучать рост аксонов и динамику конуса роста в физиологической среде с помощью изображений с высоким разрешением. Этот протокол описывает удобный для пользователя сквозной конвейер для доставки ДНК в эмбриональный мозг мыши, подготовку к высококачественным органотипическим срезам и пошаговое руководство по получению и анализу изображений.
Хотя первоначально этот протокол был разработан для изучения динамики аксонов в эмбриональной центральной нервной системе, он может быть скорректирован, чтобы обеспечить органотипическую культуру и визуализацию пластичности аксона после травматических или патологических состояний. Сам протокол относительно прост. Однако достижение его первой маркировки и сохранение структур мозга являются критическими точками.
Поэтому этапы электропорации, рассечения мозга и нарезки требуют дополнительной осторожности. Демонстрация процедуры будет полезной, и докторант из лаборатории Брекета. После обезболивания беременной самки мыши сделайте разрез, чтобы вытащить оба рога матки с помощью ватной палочки, смоченной в теплом физиологическом растворе или щипцах, осторожно захватив промежутки между эмбрионами.
Затем поместите эмбрионы на влажную марлю. После разрезания маточного мешка удалите каждый эмбрион. Поместите эмбрионы в 10-сантиметровую посуду, содержащую HBSS, дополненную глюкозой на льду.
Для внутриутробной электропорации возьмите эмбрион и поместите его в держатель. Затем осторожно вставьте стеклянный капилляр, содержащий быструю зеленую смесь ДНК, через череп эмбриона в боковой желудочек и введите два-три микролитра плазмидной смеси ДНК в каждый желудочек. Затем удерживайте голову эмбриона между платиновыми электродами пинцета под соответствующим углом, чтобы нацелиться на желаемую область мозга, при этом катод обращен к области, где предназначен перенос ДНК.
Для внутриутробной электропорации, после вытаскивания рогов матки и размещения эмбрионов на влажной марле, как показано ранее, используйте кончики пальцев, чтобы осторожно вращать эмбрион внутри матки до тех пор, пока не будут расположены лямбдоидальные и саггитальные швы. Затем осторожно вставьте стеклянный капилляр, содержащий быструю зеленую смесь ДНК, через стенку матки и череп эмбриона в боковой желудочек и введите два-три микролитра плазмидной смеси ДНК в один или оба желудочка по желанию максимум двумя микролитрами на желудочек. После инъекции удерживайте голову эмбриона между платиновыми электродами пинцета под соответствующим углом, чтобы нацелиться на нужную область мозга катодом, обращенным к области, где предназначен перенос ДНК.
После того, как все необходимые эмбрионы будут электропорированы, используйте пропитанную физиологическим раствором ватную палочку, чтобы аккуратно поместить рога матки обратно в брюшную полость. Зашить мышечные и кожные разрезы с помощью 5-0 шовного материала, затем закрепить рану с помощью шовных зажимов и продезинфицировать рану, опрыскивая ее бетадином. Поместите мышь обратно в клетку для восстановления и поддерживайте тепло с помощью дальнего инфракрасного согревающего света в течение не менее 20 минут после процедуры.
Зафиксируйте голову эмбриона под рассеченным микроскопом. Затем удалите кожу в черепе, разрезав вдоль средней линии, начиная от основания головы к носу. Очистите кожу черепа сбоку, создав достаточно большой зазор для иссечения мозга.
Далее для удаления мозга вводят закрытый кончик стерильного рассечения ножницами, начиная с обонятельной луковицы и двигаясь в сторону ствола мозга. Затем отрежьте ствол мозга и обрежьте много свободных кусков мозговых оболочек вокруг мозга. Используя перфорированную ложку, поднимите мозг и удалите лишнюю жидкость, обмакнув дно ложки в сухую папиросную бумагу.
Затем поместите мозг в блюдо с агарозой на льду. Затем, используя меньшую ложку, смешайте агарозу в течение 10 секунд для равномерного охлаждения, затем маневрируйте мозгом до середины блюда, помещая его горизонтально спинной стороной вверх и следя за тем, чтобы оно было полностью покрыто агарозой со всех сторон. Осторожно поднимите блок агарозы с рабочей станции Vibratome и высушите дно, обмакнув папиросную бумагу.
Затем поместите блок на склеенную область держателя образца ростральной стороной мозга вверх и положите держатель образца на лед. Дайте клею высохнуть в течение одной минуты. Разрезать мозг на корональные срезы под углом 15 градусов.
Затем, используя чистые шпатели, соберите ломтики мозга и поместите их на мембрану из ПТФЭ, иммобилизованную в 35-миллиметровую стеклянную нижнюю посуду с использованием Паррафина. Соберите до пяти срезов мозга на мембрану. Затем, используя пипетку 200 микролитров, удалите избыток раствора глюкозы HBSS вокруг ломтиков на мембране, оставив ломтики полусухими, затем добавьте 500 микролитров предварительно расплавленной среды срезов непосредственно в пространство под мембраной и инкубируйте ломтики при 35 градусах Цельсия с 5% углекислым газом.
Для визуализации роста аксона найдите область коры с низкой и средней плотностью клеток. В то время как для визуализации динамики конуса роста найдите конус роста в непосредственной зоне коры или субвентрикулярной зоне. Затем определите размер стека Z.
Для роста аксона в большом стеке Z установите размер шага в два микрометра, а для конусов роста в меньшем стеке Z установите размер шага в один микрометр. Для анализа данных откройте файл изображения на Фиджи, щелкнув файл, затем откройте и выберите изображение. Получите проекцию максимальной интенсивности временного интервала, щелкнув по изображению, за которым следуют стеки, Z-проекция и проекция максимальной интенсивности.
Пройдите через временной интервал и найдите растущий аксон. После обнаружения проведите линию через растущий аксон, начиная с кончика аксона в первом кадре и следуя за аксоном на протяжении всего временного интервала. Далее спойте плагин kymo re-slice wide.
Установите масштаб кимографа, перейдя к изображению, затем к свойствам. После установки расстояния в микрометрах, ширины пикселя и времени в секундах или минутах, а также высоты пикселя перейдите к анализу и нажмите измерить. Чтобы измерить объем конуса роста, откройте файл изображения в программном обеспечении для анализа изображений, щелкнув файл, откройте и выберите интересующий файл.
Затем выберите мастер добавления новых поверхностей на первом шаге, в разделе Параметры алгоритма выберите сегментировать только интересующую область, а на втором шаге обрежьте кадр, чтобы он соответствовал всему конусу роста во всех кадрах. Далее на третьем шаге поддерживайте пороговое значение до абсолютной интенсивности, а на четвертом этапе убедитесь, что вся область конуса роста является пороговой. Затем на пятом шаге в разделе Тип фильтра выберите количество вокселей LMG к единице.
Нажмите кнопку выполнить, чтобы выполнить все шаги создания и завершить работу мастера добавления новых поверхностей. Наконец, на вкладке статистика в верхней части окна мастера выберите конкретные значения и объем под подробной вкладкой. Как правило, успешно культивируемые срезы мозга, полученные из внутриутробной или внеутробной электропорации, показывают нормальное клеточное распределение и организованный массив радиальной глии с апикально ориентированными пилоконтактными процессами.
Иногда при внеутробной электропорации наблюдаются заметные нарушения в радиальных глиальных лесах и культивируемых срезах мозга, что делает это контрольное окрашивание рекомендуемым. Здесь показан репрезентативный пирамидальный проецирующий нейрон, экспрессирующий Lyn-mNeonGreen, и динамическое поведение его ростового конуса. Кроме того, нейроны были помечены с использованием плазмидного экспрессирующего актинового зонда для анализа динамики актина аксональных колбочек роста in situ.
Эксперименты in situ также проводились с двойным флуорофором cre dre, экспрессирующим плазмидную конструкцию, где флуорофоры tRFP или ZsGreen могли быть специфически и индивидуально активированы рекомбиназами dre или cre соответственно в соседних нейронах. Из кимографов легко получить динамические параметры роста, такие как скорость роста для нескольких аксонов и объем конуса роста с течением времени. Это может быть использовано для оценки скорости беговой дорожки актина и баланса между филоподиями и ламеллаподиями во время активности исследования конуса роста.
Важно поддерживать структуру мозга и точно настраивать концентрации плазмид для достижения разреженной маркировки. Это имеет решающее значение для точной визуализации аксонов и колбочек роста в коре головного мозга. В зависимости от выбранной плазмы и генетического фона этот протокол позволяет пользователям модифицировать нейроны или среду, в которой они растут, что позволяет проводить широкий спектр исследований.
Обеспечивая доступ к нейронам in situ с высоким разрешением, этот метод позволяет нейробиологам исследовать динамическое взаимодействие между колбочками роста и показателями центральной нервной системы как на морфологическом, так и на молекулярном уровнях.
