Привет всем, меня зовут доктор Бипаша Бозе. Я работаю адъюнкт-профессором и отвечаю в Центре стволовых клеток и регенеративной медицины, Научно-исследовательский центр Енепойя, Университет Енепойя, Мангалоре, Индия. Теперь мы собираемся продемонстрировать, как обнаружить наличие для ROS, то есть реактивных видов кислорода "в живых культурах из мыши глазных поверхностей, которые подверглись воздействию различных доз ультрафиолетового излучения- C.
Преимущество этой техники в том, что здесь мы можем одновременно обнаруживать наличие реактивных видов кислорода, живых и мертвых клеток, без необходимости иметь клетки Вестера. Принцип этой техники по существу заключается в проницаемости живых клеток красителя DCFDA. DCFDA является живой клетки проницаемый бесцветный краситель, который во время окислительного стресса получает действовали на внутриклеточных оксидаз и получает превращается в зеленый флуоресцирующий DCF.
Таким образом, зеленая флуоресценция позволяет нам обнаружить наличие реактивных видов кислорода в живых клетках. С другой стороны, йодид пропидия является исключительно мертвой клетки проницаемого красителя, который флуоресцирует красный. Это rDNA двухместный интеркалирующий краситель.
Тем не менее, краситель Hoechst пронизывает как живые, так и мертвые клетки. Это синий цвет ядерного пятна. Таким образом, это очень простой метод, в котором мы можем обнаружить наличие реактивных видов кислорода в долгосрочных культурах в зависимости от времени образом наряду с оценкой мертвых клеток.
Плита указать два миллиона клеток на 35 миллиметров культуры блюда. Клетки, которые мы применяем, это клетки с глазной поверхности мыши. Удалите максимальный объем мультимедиа из каждого блюда клеточной культуры.
Оставьте около 500 микролитров средств массовой информации клеточной культуры в тесном контакте с клетками. Минимальное количество мультимедиа предотвратит высыхание клеток. Тем не менее, цель минимального количества средств массовой информации заключается в том, чтобы обеспечить максимальное проникновение воздействия UVC.
Возьмите клетки под УФ-источник, это может быть либо УФ Crosslinker, или может быть любой другой ультрафиолетовый источник C. Подвергайте клетки различной дозировке излучения UVC, такой как один, 10, 100, 1000 и 10 000 джоулей на квадратный метр. Когда клетки подверглись воздействию ультрафиолетового излучения, крышки должны быть в открытом положении.
Это позволит максимально проникать в клетки ультрафиолетовым излучением И, следовательно, покажет оптимальную дозовую реакцию клеток на ультрафиолетовое излучение С. Принесите клетки к капоту потока воздуха ламинара и пополняй каждое из тарелок с 2 миллилитров вполне средств. Это полное средств массовой информации содержит 20%fetal бычьей сыворотки в DMEM, дополняется добавки, такие как 1%minimum несущественных аминокислот, а также 1%антибиотик, который пенициллин и стрептомицин.
После этого, после пополнения с максимальным объемом, то есть два миллилитров полного средства массовой информации, вернуть пластины в инкубатор и инкубировать в течение трех часов, чтобы увидеть раннее воздействие ультрафиолетового излучения. Подготовка живых клеток окрашивания средств массовой информации в последние 15 минут трехчасовой пост UVC ячейки инкубации. Окрашивание средств массовой информации готовится в 10%FBS, содержащих DMEM предварительно нагревается до 37 градусов.
Для создания 10 миллилитров окрашивания средств массовой информации, сначала добавьте пять микролитров DCFDA из запаса 10 миллимоляров, чтобы получить окончательную концентрацию из пяти микромоляров. Хорошо перемешать, трубя вверх и вниз. Во-вторых, добавьте пять микролитров раствора Hoechst из запаса 10 миллиграмм на мл, чтобы получить окончательную концентрацию в пять микрограмм на мл.
Теперь хорошо перемешать по трубопроводу вверх и вниз. Наконец, добавьте 200 микролитров йодида пропидия из запаса в один миллиграмм на мл, чтобы получить окончательную концентрацию 20 микрограмм на мл. Хорошо перемешать, трубя вверх и вниз.
Теперь раствор окрашивания готов к использованию. После трех часов инкубации после воздействия UVC, удалить пластины из инкубатора CO2. Аспирировать средства массовой информации из каждого из блюд, которые были подвержены различные дозы UVC, такие как один, 10, 100, 1000 и 10000 джоулей на метр площади.
Теперь добавьте два миллилитра свежеприготовленных живых клеток окрашивания средств массовой информации для каждого из блюд мягко со стороны блюд. Верните пластины в инкубатор CO2 снова и инкубировать в течение 15 минут для живого окрашивания клеток. После 15 минут инкубации в живых клетках окрашивания средств массовой информации, удалить окрашивание средств массовой информации из каждой из блюд, содержащих клетки подвергаются воздействию различных доз ультрафиолетового излучения.
Пополнить ячейки двумя миллилитров полных средств массовой информации. Теперь ячейки готовы к просмотру. Теперь поместите контрольные ячейки под яркое поле флуоресцентного изображения.
Клетки выглядят по-видимому нормально, так как они являются контрольные клетки. Под синим полем мы можем флуоресцирования общей клетки. Под зеленым полем показано поколение ROS.
Так как это контрольные ячейки, нет никакого ROS генерируется. Под красным полем видны иодиды пропидия, окрашенные в мертвые клетки. Затем держите УФ-излучение открытым 100 джоулей на метр квадрата под ярким полем.
Под синим полем, а также мы можем увидеть общее число ячеев под синим полем. Однако, когда мы подвергаем зеленый поле, DCFDA положительные клетки видны, а также PI положительные мертвые клетки видны. Наконец, поместите максимальную дозу УФ, то есть 10 000 джоулей на метр квадратных открытых клеток, под яркое поле.
Мы видим аномальную морфологию клеток. Тем не менее, под синим полем мы можем увидеть общее количество синих ячеек. Под зеленым полем, зеленый флуоресцирования DCFDA положительные клетки видны с указанием поколения ROS.
Когда клетки подвергаются воздействию красного поля, все клетки были флуоресцирования красный с указанием большого количества клеточной смерти, когда клетки лечатся 10000 джоулей на метр квадрат УФ дозировки. Теперь организуйте изображения, снятые в различных каналах, в единую композитную панель изображений, соответствующую дозам ультрафиолетового C и неэкспонированному управлению. Изображения расположены в одной панели в группе.
Во-первых, яркое поле. Во-вторых, голубое ядерное пятно Hoechst. В-третьих, окрашивание йодида пропидия как для мертвых ядер.
В-четвертых, DCFDA для ROS положительных клеток. И в-пятых, слитое изображение. Когда мы смотрим на первый и второй ряд изображений, то есть неэкспонированный контроль и клетки подвергаются дозе UVC один джоуль на метр квадрата, мы заметили, что не было ни PI, ни ROS положительные клетки, которые осветились, тем самым указывая на полное отсутствие ROS и клеточной смерти в неэкспонированных элементов управления и такой низкой дозы UVC одного joule на метр квадрата.
Теперь подходит к третьему ряду композитных изображений клеток, которые подверглись воздействию 100 джоулей на метр квадрата. Очень низкий процент клеток, около 10% были положительными как для PI и DCFDA в этой дозе, тем самым указывая на низкое количество генерации ROS и клеточной смерти. Теперь мы переходим к дальнейшей более высокой дозе радиационного облучения UVC, то есть 1000 джоулей на метр квадрата, как указано в четвертом ряду композитного изображения.
Здесь около 70% клеток были положительными для PI и DCFDA. Наконец, мы переходим к самой высокой дозе воздействия UVC, то есть 10 000 джоулей на метр квадрата, представленной в пятом ряду композитного изображения. Здесь были найдены, что почти 100% клеток были положительными для ИП и DCFDA, тем самым указывая на 100%-клеточную смерть и ROS поколения в этой конкретной дозе UVC.
Перенесите изображения в программное обеспечение для визуализации. Сначала откройте синее изображение, указывающее на окрашенные ядра Hoescht, то есть общее количество ячеек. Откройте инструмент подсчета голосов и нажмите на каждую из ячеек по одному, чтобы иметь номер.
Теперь откройте изображение, снятое под красным каналом с указанием PI положительных мертвых ячеек. Откройте инструмент подсчета голосов и нажмите каждое из красных пятен, указывающих на количество положительных мертвых ячеек PI. Как только подсчет мертвых ячеек закончен, нажмите на зеленый канал захваченных ячеек и откройте инструмент подсчета и нажмите каждое из зеленых пятен, указывающих на клетки, показывающие генерацию ROS.
Завершите подсчет зеленых ячеек, захваченных под зеленым каналом, а затем с помощью формулы перечислите процент гибели клеток от повреждения UVC и процент производства ROS от повреждения UVC. Это рассчитывается с помощью простой формулы количество PI положительных клеток, то есть красные флуоресцентные клетки, разделенные на количество положительных клеток Hoechst умножается на 100. Процент производства ROS путем УФ-повреждений рассчитывается с использованием формулы, количество DCFDA положительные, или зеленые флуоресцентные клетки, разделенные на количество положительных клеток Hoechst умножается на 100.
Если у вас есть оба процента, то есть процент от гибели клеток и процент производства ROS, используйте эти значения для построения барного графика. X-оси указывает дозировка УФ, в то время как у оси указывает процент клеток. Зеленые полосы указывают процент генерации ROS, в то время как красная планка указывает процент смерти клеток.
При анализе, очевидно, что в дозе UVC 100 джоулей есть 10%ROS генерации клеток, а также 10% клеточной смерти. В то время как в дозе UVC 10 подняли до трех джоулей на квадратный метр, 70% клеток выставлены ROS поколения, а также клеточной смерти. В то время как в самой высокой дозе UVC, то есть 10 поднял до четырех джоулей на метр площади, около 100%клеток выставлены клеточной смерти, а также ROS производства.
Таким образом, можно сделать вывод о том, что существует сильная положительная корреляция между поколением ROS и гибелью клеток. В заключение, этот метод очень удобен для одновременной оценки реактивных видов кислорода, живых и мертвых клеток в живой, нормальной культуре событий. Этот метод также полезен для ограниченной оценки реактивных видов кислорода, живых и мертвых клеток, в долгосрочных культурах, которые подверглись воздействию различных клеточных повреждающих веществ, таких как ультрафиолетовое излучение, или химических агентов.
И этот метод может также направлять исследователя для определения оптимального времени для сбора клеток, таких как 50%ROS, 75%ROS, так и так далее, как может быть для многих приложений вниз по течению, таких как КР для ПЦР и западной blotting.
