Мы разработали эффективный и экономичный метод установления мышей с генными манипуляциями именно в гематопоэтических стволовых клетках, используя технологию редактирования генома и системы доставки трансгенов, опосредованную оцифродуемым лентивирусом. Преимущество этого протокола заключается в том, что мы можем создавать модели животных, укрывательство конкретных мутаций в гематопоэтических клетках быстрым и рентабельным способом по сравнению с обычными трансгенными подходами мыши. Демонстрацией процедуры будет Ин Ван, исследователь из моей лаборатории.
Для генерации частиц лентивируса начните с кодирования шести хорошо пластины с коллагеновым раствором и инкубации его при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа в течение 30 минут. Затем семя 293T клетки на тарелку и инкубировать его в течение еще двух часов. Между тем, подготовить смесь из трех плазмидов трансфекции путем объединения 0,9 микрограммов переносчика лентивируса, 0,6 микрограмма psPAX2 и 0,3 микрограмма pMD2.
G и деионизированы до 10 микролитров на колодец. Затем аккуратно добавьте 50 микролитров 1X PBS и пять микролитров разбавленной PEI MAX в плазмидную смесь и инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 15 минут. После инкубации добавьте один миллилитр DMEM.
Аспирировать средства массовой информации из шести хорошо пластины и добавить один миллилитр плазмидной смеси для каждой хорошо. Инкубировать тарелку еще три часа. Замените средства массовой информации свежим DMEM и инкубировать в течение 24 часов.
Добавьте один миллилитр свежего DMEM и инкубировать еще 24 часа. После 48-часовой инкубации перенесите супернатант в 50-миллилитровую трубку и центрифуга в 3000 раз G в течение 15 минут, чтобы удалить любые свободно плавающие клетки. Фильтр супернатант через фильтр 0,45 микрометра и ультра-центрифуги его в течение трех часов.
Тщательно аспирировать супернатант, оставив после себя белую гранулу. Повторно приостанавливайте гранулы 100 микролитров без сыворотки гематопоэтической среды расширения клеток без аэрации. Держите 10 микролитера aliquot для измерения вирусного titer и хранить остальную часть подвески при минус 80 по Цельсию до готовности к использованию.
После изоляции костей поместите их в 50 миллилитровую коническую трубку с RPMI и поместите трубку на лед. В кабинете для биобезопасности перенесите кости в стерильное 100-миллиметровое культурное блюдо. Затем возьмите кость тупыми мипсами и используйте ножницы для вскрытия, чтобы тщательно вырезать оба эпифизика.
Заполните 10 миллилитров шприц с ледяной RPMI и использовать 22 калибровочных иглы, чтобы промыть костный мозг из вала в новый 100-миллиметровый блюдо культуры. После того, как все костный мозг был собран, сделать одноклеточную подвеску, передавая костного мозга через 10 миллилитров шприц с 18 калибровочных иглы. Фильтровать подвеску клетки через 70-метровый ситечко клеток в 50 миллилитровую коническую трубку.
Затем центрифуга трубки в соответствии с рукописными указаниями и аспирировать супернатант. Повторно приостанавливайте гранулы ячейки в соответствующем объеме оптимизированного буфера разделения. Чтобы изолировать отрицательные клетки линии, используйте комплект истощения клеток линии в соответствии с инструкциями производителя.
Повторно приостанавливать изолированные линии отрицательных клеток в сыворотке свободной гематопоэтической среды расширения клеток. Предварительно инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа в течение двух часов. Затем добавьте лентивирус в соответствии с рукописными указаниями и оставьте клетки в инкубаторе еще на 16-20 часов.
На следующий день, собирать лентивирус-трансдуцированных клеток в 15 миллилитров конической трубки и центрифуги их в 300 раз G в течение 10 минут. В соответствии с руководящими принципами NHA, важно обрабатывать переносчики лентивируса на уровне 2 группы Reece. Необходимо принять меры предосторожности, основанные на правилах объекта.
Тщательно аспирировать супернатант и повторно приостановить гранулы в 200 микролитров RPMI на мышь. Держите клетки при комнатной температуре до трансплантации мышам. После второй сессии облучения ретро-орбитально вводят трансинированные делинаг отрицательные клетки в каждую анестезируемую мышь с помощью инсулинового шприца.
Через три-четыре недели после трансплантации костного мозга, получить образцы крови из ретро-орбитальной вены с помощью капиллярных труб. Перенесите 20 микролитров крови в пробирки с круглым дном и поместите на лед. После лиза РБК инкубировать клетки коктейлем моноклональных антител в темноте в течение 20 минут при комнатной температуре.
После инкубации, мыть, фиксировать и центрифугировать клетки и повторно приостановить ячейки гранулы в 400 микролитров буфера FACS. Храните образцы на уровне четырех градусов по Цельсию до анализа цитометрии потока. Успех линии отрицательной трансдукции клеток можно оценить с помощью цитометрического обнаружения потока RFP.
Было продемонстрировано, что после семи дней в пробирке культуры, в среднем, 75,7% клеток транс индуцированных. Цитометрия потока также была использована для анализа периферической крови мыши после восстановления с трансиндицированными и не трансиндированных гематопоэтических стволовых клеток. В среднем 94,8% нейтрофилов, 93,5% моноцитов и 82,7% В-клеток выражают RFP.
Геномная ДНК из RFP-положительных клеток крови была усилена и суб-клонирована для анализа последовательности. Обнаруживаются различные мутации, и 69% клонов показывают вне кадра или преждевременные мутации остановки. Чтобы преуспеть в этой процедуре, требуется подготовка высокого антивирусного запаса и оптимизированные условия для трансдукции и трансплантации гематопоэтических клеток.
Мы применили этот метод для изучения права сердечно-сосудистых заболеваний. Но полезно также изучать гематологические злокачественные новообразования. Этот метод позволяет нам изучать функции новых типов генов в гематопоэтической системе высокоэффективным и высоким образом.
Мы собираем это по поводу наличия трансгенных мышей.
