Одним из ключевых преимуществ этого метода для характеристик мембранных транспортеров является то, что можно определить относительную близость транспортера к конкретным субстратам, а также получить представление о механизме транспортировки. Характеристика мембранных белков, которые используют градиенты белка для управления транспортом субстрата, особенно подходит для этого наизнанку анализа пузырьков, который мы демонстрируем здесь. Хотя этот анализ требует некоторого специализированного оборудования, такого как французская пресса и доступ к ультрацентрифугу, мы считаем, что это может быть технически проще, чем анализы, которые требуют мембранных транспортеров, которые должны быть восстановлены в искусственные липосомы.
Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет нам количественно относительное сходство для различных субстратов и делать конкурсные анализы, чтобы проверить влияние конкурирующих субстратов на транспортные решетки. В случае транспортера BAT1, используемого для иллюстрации этого анализа, мы также смогли показать субстратную активацию транспортера аргинином. Чтобы начать эту процедуру, культура подготовленных клеток-мутантов E.coli, которые выражают целевой белок путем инокуляции одной колонии в пяти миллилитров полиамина 3 средств массовой информации с соответствующими антибиотиками и выращивания его на ночь при 37 градусов по Цельсию.
На следующий день, передать эту культуру 500 миллилитров свежего полиамина 3 средств массовой информации, которая дополняется 0.0002%arabinose и расти, пока культура клеток достигает OD600 от 0,6 до 0,8. После этого центрифуга при 2000 раз G и при четырех градусах Цельсия в течение 15 минут собирать клеточные гранулы. Повторно приостановить гранулы и мыть его три раза с буфером один центрифугирования в 2000 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение 15 минут каждый раз.
Окончательный объем ячеек в буфере один за третьим спином должен быть 10 миллилитров. Установите 35 миллилитров французской ячейки давления и залить клеточной подвески в тело клетки. Включите машину с включением RHS в задней части устройства и установите переключатель селектора соотношения на высокий.
Включите насос. Поршень начнет подниматься с основания, чтобы вытеснить воздух в камеру. Увеличьте давление, повернув клапан повышения давления по часовой стрелке, пока датчик не достигнет 640 PSI.
Это создаст внутреннее давление в 10 000 PSI. Как только ячейка достигла целевого давления, откройте сборку клапана потока немного, повернув ее против часовой стрелки. Отрегулируйте отверстие клапана, чтобы скорость потока составила всего около 10 капель в минуту.
Когда стоп-линия на поршневом корпусе достигает верхней части потока ячейки переключатель насоса выключить. Опустите нижнюю пластину, поместив переключатель селектора соотношения вниз, а затем, установив переключатель насоса. Когда нижняя пластина полностью втягивается, уменьшить давление системы до нуля, повернув клапан повышения давления полностью против часовой стрелки.
Выключите насос и выключите машину. Центрифуга французской прессы eluant в 10000 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение 15 минут, чтобы удалить непрерывные клетки и клеточный мусор. Отбросьте гранулы и перенесите супернатант в ультрацентрифуговые трубки.
Ультрацентрифугировать полученный супернатант при 150 000 раз G и при четырех градусах Цельсия в течение одного часа гранулировать мембранные пузырьки. Вымойте мембранные пузырьки один раз без повторной подвески в буфере два. Затем используйте мясорубку ткани Dounce, чтобы вновь приостановить мембранные пузырьки в буфере два.
Приготовьте 100 микролитровых алицитов мембранных препаратов в 1,5 миллилитровых центрифугах и храните их при температуре минус 80 по Цельсию. Во-первых, мыть и повторно приостановить пузырьки в 30 миллимоляре Tris при рН 7,8, который содержит 0,1 миллимоляра хлорида кобальта II. Добавьте один микролитер карбоксипептидазы А в хлорид натрия, трис и хлорид кобальта II в каждый 100 образцов микролитора.
Инкубировать при 20 градусах по Цельсию в течение 20 минут. Добавьте пять микролитров раствора, содержащего ЭДТА натрия и 2-меркаптоэтанола при PH 7.5, чтобы остановить пищеварение. Инкубировать раствор при комнатной температуре в течение одного часа, чтобы полностью инактивировать фермент.
Далее добавьте от пяти до 10 микролитров раствора, содержащего литий-додекил сульфат, глицерол, бромофено-голубой и трис при рН от 7,5 до 100 микролитров образца и проанализируйте образцы электрофорезом. Для выполнения аминокислот blotting, заложить фильтр нитроцеллюлозы увлажненной с 25 миллимоляры натрия фосфат водорода на полиакриламинид гель. Поместите их между двумя увлажненными фильтрами целлюлозы, и, наконец, между двумя увлажненными пластиковыми чистящими прокладками.
Поместите эту сборку между электродами камеры, содержащей 25 миллимолярный фосфат водорода натрия при температуре от двух до четырех градусов по Цельсию. Электропереход белков на 20 вольт и на два-три усилителя в течение трех часов. Заблокировой мембраны нитроцеллюлозы в блокировании буфера на ночь при двух градусах по Цельсию.
На следующий день инкубировать нитроцеллюлозы на 20 миллилитров от одного до 5000 разбавления Анти-Его C-терминал HRP антитела и блокирование буфера в течение двух часов и мыть дважды с 50 миллилитров буфера в общей сложности 60 минут. Чтобы визуализировать помарку аминокислот, растворите шесть миллиграммов 4-хлоро-1-нафталя в 20 миллилитров денатурированного алкоголя и добавьте 80 миллилитров 15 миллимолейных три и 50 микролитров 30%перекиси водорода. Искупать фильтровальную бумагу в этом подложком растворе в течение 20 минут.
Когда достаточно цвет развился, промойте мембрану водой и дайте ей высохнуть. Для начала, инкубировать 100 микролитер aliquot мембранных пузырьков при 12 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Добавьте буфер 3, содержащий радиосламированные полиамины при конечной концентрации 50 микромоляров, к мембранным пузырькам в 1,5 миллилитров микроцентрифугных трубках для инициирования транспортировки.
Провести транспортный анализ при 12 градусах по Цельсию в течение одной минуты. После этого перенесите реакционные смеси на фильтрацию и процепивте их через 0,45-метровый нитроцеллюлозный мембранный фильтр. Добавьте три миллилитров ледяного буфера анализа, содержащего десятикратную более высокую концентрацию необнамещенных полиамина, а затем три миллилитров буфера анализа без полиамина, чтобы уменьшить неспецифическую привязку.
Перенесите промытые фильтры на 20 миллилитров одноразовых сцинтилляционных флаконов, содержащих 10 миллилитров сцинтилляционной жидкости, и используйте жидкий счетчик сцинтилляции для определения радиоактивности. Рассчитайте чистое поглощение полиамина, как указано в текстовом протоколе. Определите Км для субстрата, измерив поглощение радиозапоможенного субстрата в пузырьки, выражающих целевой белок, и вычислите кинетику Михаэлиса-Ментена с помощью нелинейного регрессивного метода.
Для конкурсных экспериментов добавьте не маркированный конкурентный субстрат, сделанный в буфере анализа, в центрифугу, содержащую 100 микролитров пузырьков при 12 градусах цельсия, одновременно добавляя 50 микромоляров радиозабеленные полиамины. Измерьте радиоактивность, захваченную внутри пузырьков, как описано ранее. Определите родительский КМ для конкурентоспособных субстратов, измерив поглощение радиозаклеймов полиамина и наличие 100 микромолейных или более высоких не помеченных субстратов и используйте нелинейный регрессионный метод для построения кривой.
В этом исследовании, анти-портье характеризуется сначала выражая белка в E.coli, а затем, генерации мембранных пузырьков, так что гетерологически выраженный белок может быть анализирован в клеточной системе. Западная помарка использована для того чтобы проверить что AtBAT1 транслокировано к vesicle. Проверка помарки с антителом Anti-His C-терминала показала протеин конструкции сплавливания который приблизительно 72.3 kilodaltons.
Переваривание пузырьков до SDS-PAGE привело к уменьшению, но не полной потере сигнала зонда. При 12 градусах по Цельсию, поглощение радиозаклейтого спермидина пузырьками является самым высоким в одну минуту и оставался линейным в течение трех минут. Таким образом, инкубацио время для анализа транспорта фиксируется в одну минуту.
Через одну минуту, нет чистого поглощения изотопов мембранных пузырьков, которые были подготовлены и хранятся на рН 8.0, как нет протонного градиента через мембрану пузырьков. Чтобы продемонстрировать эффект рассеивания искусственного протонного градиента, мембранные пузырьки инкубированы в буфере pH 8.0 в течение 10 минут до добавления помеченного субстрата, что приводит к минимальному поглощению радиозаклеевания субстрата. Взятые вместе, эти результаты показывают, что протонное поглощение спермидина связано с белком BAT1.
Для определения субстратной специфичности белка значения Км рассчитываются путем измерения поглощения радиозабрюблённого субстрата в различных концентрациях. Значения км для спермидина, путрессина и аргинина указывают на то, что этот белок является высокой сродством полиамина и аргинина обменного. Близость транспортера к конкретному субстрату также может быть косвенно определена с помощью анализа конкуренции.
Эти анализы показывают, что ГАМК является конкурентоспособным ингибитором спермидина. Кроме того, измерение поглощения 50 микромоляров радиозабеленных сперматозоидов при наличии различных концентраций различных аминокислот показывает, что AtBAT1 также способен транспортировать глутамат и аланин в миллимоляных концентрациях. При выполнении этой процедуры интеграция мембранного транспортера в бактериальную мембрану, очевидно, имеет решающее значение.
Проверка того, что белок, представляющий интерес, интегрирован в мембрану, может быть выполнена с помощью антител, направленных против тегов C-терминала. Генетическая вариация транспортеров человека может повлиять на транспортировку, как метаболитов, так и лекарств, которые являются субстратами конкретного транспортера. Таким образом, аликические изменения могут повлиять, как, поглощение и выделение наркотиков.
Многие allelic варианты могут быть быстро сделаны по стороне направленного мутагенеза гена транспортера в вектор экспрессии. Функциональные анализы этих вариантов могут быть протестированы в очень контролируемых условиях с использованием наизнанку анализы пузырьков. Мембранные транспортеры составляют от 8 до 10 всех белков, и большинство из них не были полностью охарактеризованы ни в одном из модельных организмов.
Транспортеры, которые локализованы в органелле мембраны особенно сложно охарактеризовать гетерологическим выражением в эукариотических клетках. Если тип обмена или протонные транспортеры могут быть локализованы к этой мембране E.coli, эти транспортеры могут быть функционально охарактеризованы с помощью этого анализа in vitro. На качество и урожайность пузырьков влияет скорость элюции фрагментов клеток из французской прессы.
При проведении транспортных анализов пузырьков с изотопами, важно иметь экспериментальную установку, которая облегчает проведение экспериментальных репликаций. Есть много способов сделать это, но мы считаем, что это будет полезно для нас, чтобы показать вам, как мы это сделали.
