Наш протокол работает как инструмент для поиска соединений, которые препятствуют де-активности мембраны связаны пирофосфаты. И эти ингибиторы могут быть использованы в лечении нескольких паразитарных заболеваний. Этот протокол является дешевым и простым производство стабильного цвета в течение длительного времени, не показывая каких-либо помех в присутствии высокой концентрации фосфолипида, необходимых для реактивации фермента.
Подготовь 10 миллилитров буферного раствора реактивации, содержащего 20 миллимоляр M-E-S при PH 6.5, объем 3,5% по объему глицерола, два миллимолара D-T-T и 0.05%D-D-M. Подготовка 10 миллилитров смесителя реакции, содержащий 200 миллимолярной трис гидрохлорид на PH восемь. Восемь миллимолярия хлорида магния, 333 миллимолярия хлорида калия и 67 миллимолярия хлорида натрия.
Приготовить 30 миллиграммов на миллилитр липосомы для реактивации ферментов. Во-первых, добавить 10 миллилитров 20 миллимолярной трис гидрохлорид на PH восемь, с одним миллимолярной D-T-T до 0,3 грамма L альфа фосфатидилхолин из соевой фасоли. Положите липосому на лед и sonicate с одной второй пост-интервалы в течение одной минуты.
Пауза на одну минуту, и повторить, пока решение становится прозрачным желтым. Aliquot липосомы в 100 микролитров, заморозить жидкий азот и хранить при отрицательном 80 градусов по Цельсию до тех пор, пока используется. Для реактивации фермента оттаивать липосомный раствор при комнатной температуре.
Смешайте 40 микролитров липосомного раствора с 22,5 микролитров 20%D-D-M. Держите смесь на 55 градусов по Цельсию в течение 15 минут. И дайте ему остыть до комнатной температуры.
Затем добавьте 36,5 микролитров буферного раствора реактивации. Mix. И добавить один микролитр концентрированного белка, чтобы сделать общую концентрацию 0,13 миллиграмма на миллилитр. Затем перенесите 20 микролитров активированного фермента на 1480 микролитров реакционной смеси.
Смешайте осторожно и использовать немедленно. Во-первых, растворить соединения в D-M-S-O, чтобы сделать фондовые растворы 50 миллимолей в 200 микролитров. Для растворимых соединений разбавить бульонный раствор водой до одного миллилитра в микротрубках, дать два, 10 и 100 микромолеров.
Для каждого разбавления вихрем составной раствор для правильного смешивания. После этого проверьте на наличие соединения, и с помощью многоканального пипетки, обойтись 75 микролитров реакционной смеси в каждой хорошо в 96-хорошо пластины. Добавить 75 микролитров каждого соединения и воды в качестве контроля в тройной, и смешать с помощью труб вверх и вниз в пять раз.
Измерьте каждую хорошо на 300 вольт с помощью микроплитерного нефелемера. Для приготовления раствора цитрата мышьяка весят пять граммов мышьяка натрия и пять граммов дигидрата трисидия цитрата, растворяют оба соединения в 100 миллилитров воды. Затем добавьте пять миллилитров ледниковой уксусной кислоты.
Смешайте и добавьте воду до 250 миллилитров, храните при комнатной температуре, защищенной от света. Далее, подготовить раствор, добавив 10 миллилитров ледяной 0,5 молярной соляной кислоты до 0,3 грамма аскорбиновой кислоты растворить аскорбиновую кислоту вихрем. Подготовьте раствор B, добавив один миллилитр ледяной воды в 70 миллиграммов тетратиомолибдат тетраграта аммониолита и вихря для растворения.
Храните раствор A и B на льду. Подготовить фосфатный стандарт с концентрацией ноль, 62,5, 250 и 500 микромолей для калибровки. Добавьте нулевые микролитры, 12,5 микролитров, 50 микролитров и 100 микролитров 5 миллимолярные фосфатные дисгидратные дигидраты до четырех микротрубок, содержащих 370 микролитров реакционной смеси.
Пополнить до одного миллилитра водой. Теперь добавьте один миллилитр раствора В в 10 миллилитров раствора А, перемешайте вручную и храните раствор на льду. Используя многоканальный пипетку, добавьте 40 микролитров нуля, 62,5, 250 и 500 микромоляжных фосфатов к трубным скриптам в тройном.
Затем добавьте 25 микролитров составного раствора и 15 микролитров растворной смеси M-P-P-A каждой трубки. Кроме трубок, содержащих фосфатный стандарт. Печать трубки полоски с клеем герметизации листа.
Вырежьте уплотняющий лист, чтобы отделить каждую полосу трубки. Затем предварительно инкубировать образец в течение пяти минут при 71 градусе по Цельсию. Поместите образец на отопительный блок с интервалом в 20 секунд между каждой полосой.
Для каждой полосы откройте клейую герметику. Используя многоканальный пипетку, добавьте 100 микролитров двух молярных пирофосфатных дибаз. И смешивать по трубе вверх и вниз в течение пяти раз.
Печать трубки полосы снова с помощью той же герметизации. Инкубировать снова при 71 градусов по Цельсию в течение пяти минут. После этого поместите образцы на охлаждающий аппарат с 20-секундный интервал между каждой полосой.
Пусть они остыть в течение пяти минут, а затем центрифуги каждой полосы кратко декантировать капли воды под уплотнением листа. Положите полоску обратно в охлаждающий аппарат, снимите уплотнение и дайте им остыть еще на пять минут. Затем добавьте 60 микролитров раствора А и В, смешайте с помощью трубок вверх и вниз в течение пяти раз, и держите трубчатые полосы на охлаждающем аппарате еще 10 минут.
В дымовой капот добавьте 90 микролитров раствора цитрата мышьяка и держите при комнатной температуре не менее 30 минут. Для получения стабильного синего цвета. Вылейте 180 микролитров каждой реакционной смеси в четкую 96-ну полистироловую микроплюй.
Используйте микроплатформеный спектрофотометр для измерения абсорбтности каждой пластины на 860 нанометров. В этом протоколе, восемь соединений были протестированы вместе с I-D-P, общий ингибитор пирофосфатазы в качестве положительного контроля. После добавления раствора А и В, а также цитрата мышьяка, синий цвет через 30 минут инкубации при комнатной температуре.
Все три концентрации не ингибяющих соединений, отображаются одинаковой интенсивности синего цвета. А также E-1 к E-3 без каких-либо ингибиторов. Сюжет энзиматической активности против концентрации каждого испытанного соединения показывает, что соединение с ингибисионной активностью образует нелинейную кривую установки.
Сюжет I-D-P как положительного контроля, ясно показывает снижение активности при более высоких концентрациях. Кривая ингибирования соединений один, пять, шесть, семь и восемь. Показывает половину максимальных ингибирующие концентрации на 1,7 микромолара, 21,4 микромолара, 58,8 микромолара, 239,0 микромолара и более 500 микромоляров, соответственно.
Не забудьте подготовить, решение M-P-P-A. Незадолго до начала анализа.
