Этот протокол используется для картирования и дискриминации первичных и обработанных транскриптов в митохондриях кукурузы. Этот метод включает в себя шаг нормализации РНК и сводит к минимуму влияние нестабильного пяти основных трифосфата, который препятствует четкой дискриминации между первичными и обработанными стенограммами. Помимо митохондрий кукурузы, этот метод может быть применен к пластидам и другим растительным митохондриям.
Начните со сбора 20 граммов развивающихся ядер в 50 миллилитровую трубку на льду. Перенесите ядра в предварительно охлажденный раствор и добавьте от 10 до 20 миллилитров буфера добычи ледяного холода. Измельчите ядра полностью, добавить больше буфера экстракции и фильтровать наземную ткань через два слоя фильтровальной ткани.
Центрифуга фильтрата на 8000 раз G в течение 10 минут. Затем перенесите супернатант в новую трубку и отбросьте фильтрат. Центрифуга трубки при 20 000 раз G в течение 10 минут.
Слейте супернатант и повторно приостановить гранулы в шесть миллилитров мыть буфера. Aliquot подвески в пять 1,5 миллилитров RNase свободных труб и центрифугировать их на 14000 раз G в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и заморозьте митохондриальные гранулы в жидком азоте.
Экстракт митохондриальной РНК с использованием коммерческих реагентов в соответствии с инструкциями производителя и создать РНК пять премьер полифосфатазы лечения. Затем восстановите РНК с помощью набора для очистки РНК. Реагент, используемый для извлечения РНК, опасен.
Всегда работай с ним в дымовом капюшоне и всегда носите лабораторное пальто и перчатки. Подготовьте две реакции циркуляризации, используя одинаковое количество пяти основных полифосфатазы, обработанных и необработаных митохондриальных РНК. Инкубировать обе реакции при 16 градусах по Цельсию в течение 12 до 16 часов, а затем восстановить самостоятельной лиги РНК с ранее используемым набором очистки РНК.
Начните с подготовки грунтовки смеси с равным соотношением 26 SCRT и до семи других праймеров обратной транскрипции. Соберите две системы реакции обратной транскрипции в соответствии с рукописными указаниями и инкубировать их при 42 градусах по Цельсию в течение 50 минут. Чтобы нормализовать кДНК, подготовьте две реакции ПЦР с одинаковым объемом cDNA из пяти основных полифосфатазы обработанных или необработанной РНК и запустить реакцию в условиях термоцикла, описанных в рукописи.
Нормализация на 26S зрелых рРНК является ключевым шагом для различеизации первичных и обработанных стенограмм. Сравните изобилие двух продуктов ПЦР и при необходимости оптимизируйте нормализацию путем корректировки количества шаблонов cDNA. Подготовь пары ПЦР-реакций с соответствующими объемами нормализованного кДНА и парой дивергентных грунтовок, как в пяти-трех основных стыках целевых транскриптов, и выполните ПЦР в соответствии с рукописными указаниями.
Затем используйте набор для восстановления ДНК геля, чтобы изолировать видные полосы, которые усиливаются вложенным ПЦР. Клонировать гель очищенных продуктов ПЦР в вектор, используя стандартные методы и выполнять колонии ПЦР для выбора положительных клонов, содержащих целевые вставки. Последовательность продуктов ПЦР и выравнивание данных секвенирования с геномом митохондриальной кукурузы с помощью основного локального инструмента поиска выравнивания или BLAST.
Выберите организм кукурузы и поиск базы данных нуклеотид коллекции. Найти пять премьер-три премьер-соединение круговой стенограммы и определить позиции пяти премьер и три премьер-транскрипт termini. Усильте фрагмент ДНК, используемый для подготовки РНК-зонда и клонирования его к ранее используемого вектору, который содержит промоутер T7, 17 базовых пар вверх по течению места вставки.
Этикетка РНК-зондов с копать-11-UTP и выполнять гибридизации РНК с использованием коммерческих комплектов. Дискриминировать первичные и обработанные пять основных концов, сравнивая циркулярные продукты RT-PCR, полученные из нормализованной пяти премьер полифосфатазы обработанных и необработаваемых РНК. Затем разработать количественные праймеры RT-PCR на основе результатов картирования и проверить результаты дискриминации с помощью RT-PCR.
Ген COX-2 был использован в качестве примера для демонстрации картирования и дискриминации митохондриальных транскриптов кукурузы с помощью круговой стратегии, основанной на RT-PCR. Нормализованные cDNA были использованы в качестве шаблонов для ПЦР, в результате чего две видные полосы усиливается из пяти основных полифосфатазы обработанный образец. Две полосы были названы COX-2 один и два восстановлены из геля и клонированы в векторы.
Результаты колонии ПЦР показали, что положительные клоны содержат вставки с переменным размером, что означает, что термини имеют неоднородные пять премьер или три премьер termini. Результаты секвенирования показали, что COX-2 один и два имеют те же три основных конца на 39 нуклеотидов вниз по течению стоп-кодона в то время как их пять премьер termini расположены на 992 до 1, 030 и 1, 276 до 1, 283 нуклеотидов вверх по течению от начала кодона, соответственно. Гибридизация РНК-гель помарки была выполнена для проверки круговых результатов картирования RT-PCR и были обнаружены две основные полосы размеров, похожие на COX-2.
Другая пара дивергентных грунтовок были разработаны для усиления COX-2 три и четыре полосы обнаружены с РНК гель пятно, но не с первого раза круговой RT-PCR. Количественные результаты RT-PCR подтвердили, что COX-2 один, два, три и четыре были чувствительны к пяти премьер polyphosphatase и что они были первичные пять премьер termini. Анализ расширения Primer может быть выполнен для проверки пяти основных результатов отображения, хотя он не включен в этот протокол.
