Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы обеспечить практический метод для подготовки фотокомедийных соединений с дополнительными свойствами, такими как вода solubility или клеточной ориентации способности. Используя простую синтетическую процедуру, этот метод может быть использован для расширения лаборатории над клетками соединений и сделать в клетке соединений с дополнительными свойствами без ущерба для их фоточувствительности. Этот синтез может быть выполнен в стандартной лаборатории, как наши интерактивные клетке соединений стабильны для фото-облучения при растворении в не-нуклеофильных органических растворителей, таких как дихлорметан или диметил сульфоксид.
Демонстрацией процедуры с Хироной Сасаки будут Акинобу Судзуки, постдок, Ханами Аоки и Рей Ватахики, аспиранты из лаборатории. Начните с добавления 709,6 миллиграммов метанола paBhc и 397,6 миллиграммов n n-carbonyldiimidazole в 30-миллилитровую колбу с круглым дном. Добавить сухие шесть миллилитров дихлорметана в колбу и перемешать раствор при температуре окружающей среды в течение одного часа.
В конце инкубации добавьте 342,8 миллиграмма 4-диметиламинопиридин и 552 микролитера терт-бутила шести аминокислотный карбамат и перемешайте раствор при температуре окружающей среды еще три часа. Затем используйте роторный испаритель под вакуумом, чтобы удалить растворитель и другие летучие материалы, и использовать кремнезем гель флэш-колонки хроматографии для очистки остатков непосредственно. Чтобы установить функциональный блок в щелкаемой клетке соединения, растворить 249 миллиграммов меди два сульфата пентагидрата в 10 миллилитров ионно-обменной воды, чтобы дать 0,1 моларного медного сульфата раствора.
Растворите восемь миллиграммов двух основных paBhc макет paclitaxel, 7,5 миллиграммов трис (3-гидроксипропилтриазолилметил)амин, 162,4 миллиграмма натрия-л-аскорбата и 3,1 миллиграмма 15-хлоро-3, 6, 9-триоксипентилдецидецида в смешанном растворители 2,5 миллилитров 0,1 молар фосфатного буфера и 0,5 миллилитров диметилсулфоксида. Затем добавьте 81,2 микролитера 0,1 молярного раствора сульфата меди в реакционной смеси и перемешайте смесь при температуре окружающей среды в течение 80 минут, отслеживая ход реакции с помощью HPLC. В конце реакции, решить обрывистов с 3,5 миллилитров 75%ацетилнитрилового раствора воды и применить результирующее решение непосредственно к полу-препаративной системы HPLC для очистки желаемого продукта.
Для измерения квантовой эффективности под люминесцентными лампами, покрытыми ультрафиолетовым светом, отключают фильтр, разбавляют образец стокового раствора в 10 микролитров диметилового сульфоксида 10 миллилитров буфера KMOPS. Перенесите алицит раствора в ту же пробирку, используемую в фотореагентной реакции химического актинометра. Облучать образец раствора 350 нанометровым светом в течение пяти секунд, периодически удаляя 50 микролитровых алицитов из облученные растворы для анализа HPLC.
Затем определите время облучения в секундах, в которых 90% исходного материала реагировали на установку участков времени зависимого исчезновения исходного материала. Для HaloTag лиганд ориентации интерактивных клетке соединения, урожай целевой группы населения интерес с соответствующим реагентом диссоциации клеток и повторно приостановить клетки в 2,5 раза от 10 до пятой клетки на миллилитр концентрации DMEM. Затем семена примерно от 10 до пятой клетки на блюдо в 35 миллилитров стекла нижней блюда для ночной инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа.
На следующее утро разбавляют 14 микрограммов ДНК ПК тремя гало эпидермальным фактором роста рецептора плазменной ДНК в 1,5 миллилитровой микро центрифуге трубки, содержащей 700 микролитров уменьшенной среды сыворотки. Затем добавьте пять микролитров реагента липофекции в 150 микролитров пониженной среды сыворотки к каждой из четырех трубок и позвольте трубам стоять при температуре окружающей среды в течение пяти минут. В конце инкубации добавьте 150 микролитров разбавленной плазменной ДНК к каждому из разбавленных образцов реагентов липофека и инкубировать образцы при температуре окружающей среды еще пять минут.
В конце инкубации, промыть клетки с двумя миллилитров PBS на блюдо и добавить 1,5 миллилитров уменьшенной среде сыворотки к каждой культуре. Добавьте к каждому блюду 150 микролитров плазмидного реагентного комплекса липофекции и верните клетки в инкубатор клеточной культуры в течение 48 часов. В конце инкубации, аспирировать supernatants и добавить один миллилитр свежеприготовленных DMEM дополнены двумя микромолярной paBhc hex fitzi гало к каждому блюду.
После 30 минут при 37 градусах по Цельсию, аспирировать среды, содержащей в клетке соединения и промыть клетки два раза с одним миллилитром PBS плюс удалить любые несырья соединений. Добавьте 500 микролитров уменьшенной среды сыворотки к каждому блюду и верните клетки в инкубатор клеточной культуры еще на 30 минут, чтобы удалить соединения, которые вошли в клетки. В конце инкубации, промыть клетки два раза с одним миллилитрОМ PBS плюс на блюдо и добавить один миллилитр среды без фенола красный к каждой культуре.
Затем записывают изображения флуоресценции с помощью лазерного сканирования микроскопии конфокального флорескции. Для фото-опосредованой модуляции локализации киназы с помощью щелкаемого соединения в клетке, семя примерно пять раз от 10 до пятого TOC-A-one клеток в двух миллилитров F12 среды ветчины на 35 миллилитров стекла нижней блюдо. На следующий день, трансфект клеток с плазмидным кодированием для GFP diacylglycerol киназы гамма в течение 48 часов, как только что продемонстрировали.
После окончания трансфекции замените супернатант трансфекции двумя миллилитров пониженной среды сыворотки. Добавить 20 микролитров 100 раз paBhcAA рабочий раствор для клеток в течение пяти до 60 минут инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. В конце инкубации поместите блюдо на объективную стадию перевернутого флуоресцентного микроскопа, оснащенного двойным световым источником флуоресцентного осветителя.
Изображение клеток каждые 10 секунд в течение 10 минут при облучении клеток в соответствующих экспериментальных точек времени и длины волн в соответствии с экспериментальным протоколом. Используя этот метод, как попродемонстрировано, интерактивные клетки соединений некоторых биологически интересных молекул, в том числе паклитаксель и арахидоновая кислота, могут быть успешно синтезированы. Дополнительные свойства, такие как водонепроницаемость воды и способность клеточного таргетинга могут быть введены в paBhc макет paclitaxel через медь один катализированную реакцию клика циклизации.
Эти интерактивные клетки paclitaxels затем могут быть фотолайсированы для производства своих родительских соединений при облучению на 350 нанометров. Физические и фотохимические свойства интерактивных клетчатых соединений суммируются в таблице. В живых клеточных экспериментов, ориентации paBhc hex fitzi гало культурных клеток млекопитающих преходяще выражая HaloTagged белка и эпидермального фактора роста рецептор вызывает зеленый сигнал флорескции от флуоресцентного moiety PAHBHC hex fitzi гало на клеточной мембране.
Кроме того, лечение клеток CHO-K1, преходяще выражаюх GFP diacyl glycerol kinase гамма с арахидоновой кислотой, вызывает модуляцию субклеточной локализации диазилгликола киназы гамма. Аналогичные изменения в диакилглицерол киназы гамма-локализации также наблюдаются в paBhc-AA обработанных клеток после воздействия УФ-излучения. При выполнении экспериментов caging в aqueous решений увеличения культуры среды, не забудьте всегда работать под флуоресцентной лампы с короткой длины волны ограничен фильтр.
После этой процедуры, вы можете изучить клетке соединений, которые были в изобилии для использования в биологических экспериментах из-за отсутствия воды solubility, мембраны проницаемости или клеточной ориентации способности.
