Этот протокол позволяет нам контролировать динамику взаимодействия и разрешение перекрестка Холлидей с помощью лоскутной эндонуклеазы 1 на уровне одной молекулы и других энзиматических систем. Ну, некоторые будут усреднения по всей молекулярной популяции или обеспечивает основные индивидуальные механистические шаги и есть. Методы одной молекулы обеспечивают эти детали путем мониторинга поведения отдельных молекул в режиме реального времени.
Методы одной молекулы могут эффективно обнаруживать биомолекулярные взаимодействия в диапазоне пико и наномоляров с высокой специфичностью. Что удобно для многих практических решений в диагностике, секвенировании генома и зондировании. Оптические и принудительные методы измерения одной молекулы широко применяются в физике, химии и биологии и, как доказано, обеспечивают благородные наблюдения, недоступные другими методами.
Мой совет для впервые пользователей заключается в том, чтобы внимательно следить за подробные шаги, изложенные в этом протоколе. Визуальные иллюстрации практической процедуры этого протокола приведут к успешной реализации методики. Чтобы подготовить одноканайную ячейку потока, начните с бурения двух отверстий диаметром 1,22 миллиметра в средней части кварцевой горки диаметром 50 на 20 миллиметров с разрозней центрами на 37 миллиметров и на 6,5 миллиметра от края горки.
Используйте электронный резак, чтобы сократить 41 на 2,25 миллиметра канала в 50 на 20 миллиметров кусок двойного клея листа и снять пластиковую сторону защитной крышки. Выровняйте края фигуры с краями кварцевой горки и используйте пару полиэтиленовых пинцетов для мягкого удаления любых захваченных пузырьков воздуха. Снимите бумажную сторону клея и смонтировать кусок на функциональной поверхности крышки скольжения.
Затем вырежьте один кусок полиэтиленовой трубки с внутренним диаметром 1,22 миллиметра до 11 сантиметров длиной для вставки и один кусок трубки до 25 сантиметров для розетки. Затем вставьте трубки в ранее просверленные отверстия в качестве входных и розетки труб для потока ячейки. И использовать пять минут эпоксидного клея, чтобы запечатать края кварцевой крышки скольжения интерфейса в входе и розетке труб.
Когда клетка высохла, используйте 1 миллиметр шприца, чтобы промыть 0,2 микрометра фильтруется 0,03 миллиграмма на миллилитр концентрации avidin в PBS в клетку с помощью второго шприца заполнены буфером только для мытья любого избытка avidin в конце изобилия. Для выполнения одноцветного эксперимента FRET сначала нанесите одну каплю масла погружения на 100-кратную цель внутреннего отражения флуоресценции и установите на чипе умножение фотоэлектронов на подходящий выигрыш для оптимизации сигнала на заднем плане и предотвращения насыщения. Аккуратно поместите ячейку потока на держатель образца и используйте регулировку курса, чтобы постепенно поднять цель до тех пор, пока масло не коснется крышки скольжения.
Включите лазер 532 нанометров и переключитесь на режим тонкой регулировки цели. Навейте выбросы в порт камеры, чтобы наблюдать за изображением на мониторе и регулировать высоту цели до тех пор, пока функциональное покрытие крышки не будет скольжено в фокусе и не будет наблюдаться на мониторе. Убедитесь, что фон с функциональной поверхности крышки скользит не превышает несколько пятен, прежде чем течь в флуоресцентно помечены HJ. Когда система будет готова на 0,2 до 0,5 микролитров разбавленного субстрата интереса в 120 микролитров буфера изображения с кислородной системой очистки в 0,5 миллилитровую трубку и подключить выход медленной ячейки к шприц-насосу.
Вставьте входную трубку в 1,5 миллилитровую трубку и запустите шприц-насос на 30-50 микролитров в минуту, чтобы снять раствор из трубки. Часто изображение поверхности кратко с зеленым лазером, чтобы подтвердить хорошее покрытие клетки со 100 до 300 частиц однородно распределены, хорошо распределено субстрата. Если поверхность клетки потока адекватно покрыта, промыть еще 120 микролитров буфера изображений на 30 до 50 микролитров в минуту, чтобы смыть любой несвегающий HJ и позволить клетке потока сидеть в течение 5 минут, чтобы кислородная система струйки истощать растворенный кислород.
Установите время экспозиции примерно до 60 миллисекунд. Время цикла будет автоматически устанавливаться программным обеспечением на основе скорости передачи данных. Укажите нужное количество циклов или кадров примерно до 400.
Выбросы от донора и флюорофоров принимаетеля делятся на цветные каналы устройством сплиттера изображений. Выберите подходящую область на поверхности, отрегулируйте высоту цели, чтобы сфокусировать изображение и записать и сохранить фильм в формате 16 бит tiff. Затем переместись в новую область.
Промыть клетку 120 микролитров буфера изображений, дополненных указанными концентрациями GEN1 при скорости потока 30 микролитров в минуту, по одной концентрации за раз. В разрешении эксперимента по расщеплению HJ отрегулируйте скорость потока до 110 микролитров в минуту и начните запись за 5-10 секунд до входа фермента в клетку потока. изображение, чтобы начать от 5 до 10 секунд до входа фермента в клетку потока будет максимизировать количество событий.
Когда все концентрации были протестированы, используйте фиксированный флуоресцентный слайд шарика, чтобы сопоставить частицы донора и принимаетеля друг с другом в устройстве разделения изображений. После установки соответствующего пакета программного обеспечения для создания матрицы преобразования, откройте записанный шарик слайд фильм и выбрать позиции отдельных бусин в донорских и приемоктор каналов. Когда матрица была создана из фиксированного слайда шарика нажмите Load TFORM и выберите файл матрицы преобразования.
В меню фильтра канала опустите меню, нажмите на опцию D и A, чтобы выбрать для частиц, помеченных как донором, так и принимаеттелем. Затем введите plotTimetraceCW в соответствии с инструкциями в руководстве для генерации следов времени для каждой молекулы. Для выполнения эксперимента ALEX FRET завехайте фильм, состоящий из последовательных кадров донорских и приемокторских выбросов путем прямых возбуждений с помощью зеленых и красных лазеров.
Откройте приобретенные фильмы ALEX и установите подходящий порог обнаружения на уровне примерно 300 для каждого из донорских выбросов из-за возбуждения донора, выброса приемора из-за возбудивания донора и выброса acceptor из-за прямых каналов возбуждения. Примените соответствующие фильтры каналов, чтобы выбрать для частиц, которые были как донором, так и принимаеттелем, и связать от 200 до 300 частиц в каждом из трех каналов. Используйте код plotHistALEX MATLAB для генерации гистограмм ALEX, соответствующих различным пикам в функциях гистограммы, и используйте подходящую программу графикирования и анализа для определения процентной доли области под кривой для каждой популяции.
Затем используйте код plotTimetraceALEX MATLAB для генерации трассировки времени для каждой молекулы, показывающей выброс донора прямым возбуждением в выбросах приемора из-за FRET и прямого возбуждения. Этот представитель чередуя возбуждение FRET гистограмма соседней этикетки X-0 показывает два пика, которые соответствуют обмену более обильные и менее обильные изомеры. Показатели изомеризации, полученные из гистограмм времени жилищ изомеров, соответствуют тем, о них сообщалось ранее.
Одноя молекула FRET гистограммы соседней этикетки X-0 соединения в различных концентрациях GEN1, приобретенных ALEX, выявить один пик, соответствующий свободной высокой FRET изомера и один пик, соответствующий связаны HJ населения после вычитания вклад менее обильные изомера от низкого пика FRET. При насыщении концентрации GEN1 гистограмма FRET X-0 имеет только один низкий пик FRET, соответствующий GEN1, связанный с либо изомером HJ, как это было предсказано моделью. Привязка мономера GEN1 к HJ с последующим образованием димера является уникальной особенностью эукариотической ХДж-решения GEN1 по сравнению с прокариотическими растворимами, которые существуют в димерикической форме в растворе.
Еще одним доказательством того, что мономер GEN1 связывает и искажает HJ, является наблюдение значительного количества следов нечистых частиц со стабильным низким состоянием FRET при наличии магния при низких концентрациях GEN1. Одновременный отъезд донора и принимаетеля после стабильно низкого состояния FRET в следах разрешенного X-0, который происходит без появления промежуточного указывает на то, что полное разрешение происходит в течение всего срока службы комплекса GEN1 HJ. Обратите внимание, что фон функциональной стеклянной поверхности не должен превышать нескольких пятен и что равномерно распределенные частицы необходимы для получения хороших результатов.
Всегда используйте средства индивидуальной защиты и дым капот при подготовке серийной картины. Обязательно носите защитные очки, характерные для длин волн при работе с лазерами. Другие методы, такие как крио ап, ядерный магнитный резонанс, может обеспечить атомный уровень структурных деталей.
Эта информация является неотъемлемой частью для разработки и интерпретации одной молекулы FRET экспериментов. Единая молекула FRET открывает новые взгляды в области репликации ДНК, что приводит к более глубокому пониманию механизмов действий геликавов и ядер.
