Таким образом, наша модель позволяет изучать пост-транскрипционные модуляции конкретной стенограммы в альвеолярных эпителиальных клеток в первичной культуре и их физиологических и патофизиологических условиях. Таким образом, преходящая трансфекция первичных альвеолярных эпителиальных клеток имеет минимальное влияние на физиологию клеток и обмен веществ, что представляет собой явное преимущество перед классическими протоколами с использованием ингибиторов транскрипции. Для генерации плазмидной реакции, выражаюной интерес к гену, необходимо проанализировать последовательность гена и многочисленные места клонирования неопределимого вектора, чтобы определить последовательности распознавания в нескольких местах клонирования, которые внутренне не присутствуют в гене.
Используя полимеразу высокой точности taq и стандартные методы перекрытия ПЦР, фланговый ген интереса с двумя выбранными местами распознавания ферментов ограничения с использованием конструктора грунтовки. Необходимо включить последовательность в кодировании эпитопа V5 вверх по течению от гена, представляющий интерес, чтобы отличить экспрессию трансфицированного гена от эндогенной экспрессии. Мутанты могут быть порождены последовательным удалением для изучения влияния различных трех основных непереведенных областей на стабильность мРНК гена с помощью обратных грунтовок, кодирующих полиаденилирующий сайт, который постепенно удаляет три основных конца непереведенной области.
В конечном счете, вставка гена интереса может быть подтверждена анализом ограничений. Ориентация гена и отсутствие мутаций, потенциально введенных во время rtPCR, могут быть подтверждены секвенированием. Для трансфекции первичных крыс легких типа два альвеолярных эпителиальных клеток, семена клеток в один раз от 10 до шестого клеток на квадратный сантиметр в 100 миллиметров Петри блюда в присутствии полного минимального необходимого среды.
Культура в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия при 5%углеродном диоксиде с влажностью. На следующий день добавьте 500 микролитров полной среды без антибиотиков к каждому колодец новой 12 хорошо пластины и предварительно разогреть пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут. Во время этой инкубации добавьте один микрограмм плазмиды реакции и один микрограмм регулятивного вектора к одной 1,5 миллилитровой трубке на колодец.
Вымойте альвеолярные эпителиальные клетки с 10 миллилитров на колодец 37 градусов по Цельсию PBS без кальция или магния и лечить клетки с пятью миллилитров на колодец 37 градусов по Цельсию 0,05%трипсина в течение двух-четырех минут в инкубаторе клеточной культуры. Когда клетки отсоединились, нейтрализовать трипсина с 10 миллилитров на колодец полной среды без антибиотиков и собирать клетки в новую 50 миллилитровую трубку. Вымойте блюдо с четырьмя миллилитров свежей среды, чтобы собрать все оставшиеся клетки и осадок клеток центрифугации.
Повторное распределение гранул в один миллилитр PBS для подсчета и центрифуги клеток снова. Переусердуйте гранулы при плотности в четыре раза от 10 до седьмого ячейки на миллилитр буфера повторного незаменимия и добавьте четыре раза по 10 к пятым клеткам к каждой трубке плазмиды и вектора с нежным смешиванием. Поместите одну трубку в электропорацию устройства и заполнить трубку с 3,5 миллилитров электролитического буфера.
Полностью угнетайте поршень, чтобы вставить позолоченный наконечник электрода в пипетку и аккуратно смешать содержимое трубки. Тщательно аспирировать клетки с пипеткой и вставить пипетку в электропорации станции, пока щелчок звук не будет услышан. Выберите соответствующий протокол электропорации для альвеолярных эпителиальных клеток и нажмите Start на сенсорном экране.
Сразу же после трансфекции снимите пипетку и перенесите клетки в один колодец предварительно разогретой 12 хорошо пластины. Когда все клетки были электропотери и поцаречены, поместите пластину в инкубатор клеточной культуры, заменив супернатант в каждом хорошо с полным среды с антибиотиками через два дня. Успех трансфекции может быть подтвержден экспрессией EGFP, наблюдаемой флуоресцентной микроскопией или цитометрией потока с использованием вектора контроля.
Чтобы ингибировать транскрипцию гена интереса, 72 часа после трансфекции заменяют супернатант одним миллилитром на колодец полной среды, дополненной одним микрограммом на миллилитр свежеприготовленного адоксициклина. Для оценки полуготовности мРНК гена интереса, вернуть пластину в инкубатор клеточной культуры от 15 минут до шести часов. Мытье один хорошо с одним миллилитров ледяной PBS перед лизированием клеток с 500 микролитров лиза буфера из коммерчески доступных фенол хлороформ РНК извлечения комплекта и нежный встряхивания в каждой экспериментальной точки времени.
Затем изолируйте РНК в соответствии с инструкциями комплекта и определить урожайность и чистоту РНК по спектрофотометрии на 230, 260 и 280 нанометров. Чтобы определить стабильность изолированной РНК, сначала обработать один микрограмм общей РНК из каждого образца с RNase бесплатно DNase один, чтобы удалить любые следы плазмидной ДНК. Используйте коммерчески доступный комплект синтеза cDNA со смесью олиго dT и случайных гексомер праймеров для улучшения эффективности обратной транскрипции, чтобы обратить вспять транскрибировать ДНК обедненной общей РНК в cDNA в соответствии с инструкциями производителя.
Добавьте 180 микролитров воды класса молекулярной биологии в 20 микролитров реакционной смеси, чтобы разбавить реакцию cDNA на пять нанограмм на концентрацию микролитера и немедленно разбавить смесь cDNA свежей молекулярной биологией класса воды для достижения 1,25 нанограмма на микролитер концентрации. Объедините пять микролитров киберзеленого красителя мастер смеси с 0,1 микролитера молекулярной биологии класса воды, 0,45 микролитров 7,5 микромолярной вперед грунтовки, 0,45 микролитров 7,5 микромолярной обратной грунтовки, и четыре микролитров 1,25 нанограмма на микролитр CDNA для получения общего объема реакции 10 микролитров. Поместите образцы в qPCR термоциклер и усилить V5 тег гена интереса и тетроциклин трансактиватора заранее amplicons с использованием условий qPCR, как указано, и генерировать высокое разрешение плавления кривой для оценки конкретных температур плавления желаемых ампликонов и обеспечить отсутствие пиков шума ампликона.
Этот метод электропорации пипетки облегчает скорость 25-30%трансфекции, как это наблюдается в соотношении клеток EGFP, обнаруженных с помощью флуоресцентной микроскопии и цитометрии потока. Лечение альвеолярных эпителиальных клеток с одним микрограммом на миллилитр доксициклина не оказывает существенного влияния на экспрессию эндогенной альфа-мРНК в любой момент времени в течение периода лечения. Используя транскрипционно контролируемую плазминированную систему выражения, как попродемонстрировано, сигнал V5 alpha ENaC может быть нормализован в соответствии с расширенным сигналом трансактиватора тетрациклина для определения эффективности трансфекции с помощью метода двойного цикла количественной оценки дельты.
Период полурасохраны альфа ENaC mRNA в семь раз короче при наличии тетрациклина вне системы, чем при наличии актиномицина D, подтверждая, что актиномицин D приводит к артефактной стабилизации альфа ENaC mRNA. Кроме того, циклохексамид и фактор некроза опухоли альфа-обработка значительно снизили стабильность транскрипта, в то время как липополисахариды этого не делают. Значительные изменения в модуляции V5 альфа ENaC мРНК стабильность может быть вызвана в зависимости от удаленных и включены регионы трех основных непереведенных области.
Кроме того, чрезмерное выражение специфических связывающих РНК белков снижает стабильность 5-альфа-мРНК ENaC по сравнению с трансфекции с пустой плазмидой PCDNA три. Этот инструмент будет полезен для запроса новых идей в пост-транскрипционные регуляции ключевых генов, участвующих в функции альвеолярного эпителия и их физиологических или патологических состояний.
