Было бы весьма полезно для размножения черты, которые технически трудно или дорого, чтобы быть определены, такие как устойчивость к болезням, содержание минералов. Это довольно простая, экономия и высокая пропускная способность. Для начала поместите четыре листа дисков в каждый колодец 96-хорошо ПЦР пластины.
Добавьте в каждую колодец 50 миллилитров буферного раствора А. Заморозить тарелку в морозильной камере минус 80 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Затем разморозить пластину при комнатной температуре.
Инкубировать при 95 градусах по Цельсию в течение 10 минут. Добавьте 50 микролитров буфера B к каждой хорошо, и хорошо перемешать вихрем. Центрифуга пластины в течение одной минуты при 1500 раз г.
Соберите супернатант в качестве ДНК для ПЦР. Во-первых, используйте супернатант ДНК от одного хорошо, как шаблон ПЦР для оптимизации температуры annealing. Добавьте реагенты и один микролитр супернатанта ДНК в каждый ПЦР хорошо.
Поместите трубы ПЦР в тепловой блок, способный градиента, и отрегулируйте программу нагрева в соответствии с рукописью, чтобы определить оптимальную температуру для каждого фрагмента цели. Выполните электрофорез для продукта ПЦР на 1%agarose гели для изучения ампликонов. Определите оптимальную температуру анеаля, которая позволяет конкретное усиление фрагмента цели.
Для проведения анализа HRM объедините реагенты, включая один микролитер 10-х раз флуоресцентного красителя и один микролитер супернатанта ДНК в каждом колодец HRM-совместимых пластин. В каждой пластине, включают один дикий тип родительского образца и один отрицательный контроль без ДНК. Добавьте каплю минерального масла в каждую колодец, чтобы предотвратить испарение.
Затем загерметив пластину клейкой пленкой и центрифугой по 1000 раз г в течение одной минуты. Запустите ПЦР с использованием оптимизированной температуры аннеаля. Теперь снимите клейкую пленку с пластины и вставьте пластину в машину HRM.
В программном обеспечении выберите New Run из меню файла или нажмите кнопку Run в верхней части экрана. Укажите начальную и окончание температуры расплава от 55 до 95 градусов по Цельсию. Выберите образцы для анализа плавления с высоким разрешением и исключите образцы, аналогичные отрицательному контролю.
Нормализация кривых плавления, чтобы иметь то же начало и окончание флуоресценции. Визуально подтвердите, что курсоры более низкой минимальной и низкой максимальной температуры находятся в области кривых. Держите дельту F, разницу флуоресценции, уровень по умолчанию настройки 05.
Из списка выбора Стандартов выберите общий по сравнению с вариантом и выберите нормальную чувствительность. Выберите H12 для использования дикого типа в качестве элементов управления. Образцы с значением дельты F, более 05, считаются содержат мутантное растение.
Затем, используя метод CTAB, извлечь ДНК из каждого из четырех растений из мутантного бассейна с кривой плавления значительно отличается от дикого типа. После количественной оценки с помощью спектрофотометра, отрегулируйте ДНК с NanoDrop 2000 до окончательной концентрации примерно 25 нанограмм на микролитр. Добавьте 0,4 микролитров праймеров ПЦР в образец ДНК в трубах ПЦР, поместите их в тепловой циклер и отрегулируйте программу для усиления фрагмента цели.
Затем отправьте продукты PCR компании для секвенирования. После секвенирования Sanger сравните молекулярное поражение, сравнив последовательности между растением M2 и диким типом. В этом исследовании, HRM сканирования и анализа саженцев M2 для мутаций в OsLCT1 или SPDT генов показали, что большинство образцов были плавления кривых не значительно отличается от дикого типа с дельтой F менее 05.
Мутанты показали значительно разные кривые HRM с дельтой Fs больше 05 при температуре от 90 до 92 градусов по Цельсию и от 81,5 до 83,5 градусов по Цельсию, соответственно. Тип мутации и положение на генах из 4 560 M2 саженцев были подтверждены секвенированием хроматограмм. Выявлен гетерозиготный участок с мутацией от G до A на 4, 304 базовых парах OsLCT1.
Одна вставка нуклеотида А появилась на 4, 240 базовых парах OsLCT1, а удаление тринуклеотида TTC наблюдалось в положении 5, 948 до 5, 950 базовых пар SPDT. Я оптимизирую ПЦР до анализа HRM. Краситель в гель немного вредно.
Не забудьте надеть перчатки при запуске геля.
