Параспония является тропическим деревом из семьи каннабиса, который способен установить азотфиксации симбиоза с ризобием. Сравнительные исследования между Параспонией и бобовых могут дать представление о основных генетических сетях, лежащих в основе симбиоза ризобия. С помощью этого протокола, Parasponia andersonii стабильные трансгенные линии мутантов могут быть созданы в течение двух-трех месяцев.
Эти линии могут эффективно распространяться через распространение in vitro. Этот протокол предоставляет экспериментальную платформу для изучения ризобиального симбиоза, а также других аспектов биологии этого тропического дерева. Для реализации этого протокола достаточно базовых навыков в области культуры тканей и молекулярного клонирования.
Это позволяет любой лаборатории адаптировать Parasponia в качестве исследовательской модели. Демонстрация процедуры будет аспирантов Титис Wardhani и Yuda Roswanjaya вместе с Marijke Hartog, техник в нашей лаборатории. Чтобы вырастить деревья Parasponia andersonii, начните с прорастания семян.
Удалите семена из ягод Параспонии, потирая на внутренней стороне сито чая или давя их на листе бумаги. Дезинфицировать семена с помощью 4%гипохлорита отбеливатель в течение 15 до 20 минут, а затем мыть семена шесть раз с стерилизованной водой. Перенесите семена в стерильные 200 микролитровЫх ПЦР-трубок и заполните трубки стерилизованной водой, чтобы погрузить семена.
Инкубировать трубки в течение 10 дней в термоциклер в соответствии с рукописными указаниями. После 10-дневной инкубации перенесите семена на пластины SH-0 и закройте их двумя слоями эластичной уплотнительной фольги, чтобы предотвратить высыхание. Инкубация при 28 градусах по Цельсию с 16-часовым дневным восьмичасовым циклом в течение трех-четырех недель.
Как только саженцы разовьют свой первый набор истинных листьев, перенесите их в горшки, заполненные коммерческой почвой для заливки, и накройте их полупрозрачным пластиковым стаканчиком, чтобы предотвратить высыхание. Поместите горшки в 28-градусный по Цельсию, 85% относительной влажности климата комнате или теплице под 16-часовой день, восемь часов ночи режима. Через неделю снимите пластиковый стаканчик.
Регулярно поливать горшки, и дополнить удобрениями для поддержания роста деревьев. Подготовка к преобразованию путем сбора молодых пяти-восьми сантиметров ветви из тепличных деревьев, убедившись, что использовать только здоровые, неинфицированные ветви. Отрежьте листья, оставляя один сантиметр в квадрате листовой ткани в конце каждого петиола.
Дезинфицировать ткань в течение 15 минут с 2%гипохлорит отбеливатель, содержащий несколько капель полисорбата 20, а затем промыть его восемь раз с автоклавной водой. Повторно приостановить Agrobacterium клеток в 25 миллилитров инфильтрации среды до оптической плотности около пяти. Разрежьте стебель и ткань петиола на односемейные кусочки внутри клеточной подвески.
Удалите ткани листьев и инкубировать стволовые и петиол штук в клеточной суспензии в течение 10 до 30 минут. Высушите кусочки тканей на стерильном листе фильтровальной бумаги и поместите их на укореняющий носитель, подготовленный в соответствии с рукописными указаниями. Инкубировать пластины в темноте при 21 градусов по Цельсию в течение двух дней.
После двух дней, проверить пластины для грибкового или бактериального загрязнения и отказаться от загрязненных пластин. Перенесите кусочки ткани на 10 миллилитров среды SH-10, подготовленных в соответствии с рукописными указаниями. Оставьте ткань в среде, по крайней мере 10 минут, и осторожно агитировать каждые две-три минуты, чтобы вымыть.
Приготовьте укоренения среды с цефотаксимом и канамицином в соответствии с рукописными указаниями, и залейте пластинами. Высушите ткани на стерильных кусочках фильтровальной бумаги и перенесите их на тарелки. Инкубационые пластины в течение семи дней при 28 градусах по Цельсию в соответствии с 16-часовым дневным, восьмичасовым режимом.
Проверяйте пластины на грибковое или бактериальное загрязнение каждые два дня. Если происходит загрязнение, перенесите неинфекционые части ткани на свежую тарелку. Через семь дней перенесите части ткани в среду распространения, подготовленную в соответствии с рукописными указаниями, и инкубировать при 28 градусах по Цельсию в соответствии с 16-часовым режимом восьмичасовой ночи.
Освежите пластины один раз в неделю, пока трансгенные побеги развиваться, убедившись, что только передача неинфицированных частей ткани на новые пластины. После того, как мнимые трансгенные побеги, по крайней мере один сантиметр длиной, сократить побеги и культуры их самостоятельно в распространении среды с антибиотиками. Для того, чтобы побеги представляли собой независимые трансформанты, возьмите только один выстрел с каждой стороны explant.
Прораспространяй ткань, поместив около 10 побегов на свежую тарелку среды распространения и закрыв пластину двумя слоями эластичной уплотнительной фольги. Инкубировать пластины при 28 градусах по Цельсию в соответствии с 16-часовой день, восемь часов ночи режим, и повторить этот шаг каждые четыре недели. Когда побеги достигают одного сантиметра в длину, вырезать их у их основания и поместить их на укоренения среды.
Распоить побеги вертикально, вставив базальный кончик стрелять в среду. Около 10 побегов можно разместить на одной тарелке. Начните с подготовки ризобия inoculum.
Прививка 10 миллилитров жидкой среды YEM из одной колонии Mesorhizobium plurifarium BOR2, и инкубировать при 28 градусах по Цельсию в течение двух дней. Используйте эту культуру для прививки большего объема жидкой среды YEM. После того, как выросли, центрифуга бактериальной культуры в течение 10 минут при 3500 раз г для сбора клеток.
Повторно приостанавливайте бактериальные гранулы в жидкой среде EKM и определите оптическую плотность. Приготовьте три литра среды EKM, которых хватит примерно на 20 горшков, и прививки от корневой подвески. Смешайте среду с 1,25 кг перлита и добавьте 210 граммов этой смеси в стерильные полупрозрачные полипропиленовые горшки.
Завод от одного до трех Parasponia andersonii растения для каждого горшка, и подготовить несколько горшков с plantlets преобразованы с контрольной конструкцией. Взвесить несколько горшков, и покрыть дно каждого горшка, чтобы оградить корни от воздействия света. Инкубировать горшки в климатизированной комнате роста на 28 градусов по Цельсию в соответствии с 16-часовой день, восемь часов ночи режим в течение четырех-шести недель.
Раз в неделю, весят несколько горшков, чтобы определить потерю воды. Если потеря воды превышает 10 миллилитров, дополнить ультра-чистой водой, чтобы компенсировать потерю. После инкубации очистите корни от перлита и определите номера узлов с помощью бинокля.
Этот метод был использован для успешного преобразования петиол и сегментов Parasponia andersonii стебли с agrobacterium штамм AGL1. Во-первых, ткани explants совместно культивируются с Agrobacterium в течение двух дней. Длительное совместное культивирование приводит к чрезмерной колонизации бактерий и должно быть предотвращено.
Несколько недель спустя, небольшие зеленые микро-калли наблюдаются вдоль первоначальной поверхности раны. Эти калли продолжают расти и развивать один или несколько сшатимо преобразованных побегов в шесть-восемь недель после начала трансформации. Эффективность преобразования варьируется от 10 до 30% для тканевых эксплантов от зрелых ветвей до 65-75% для тканевых эксплантов из молодых и быстро растущих ветвей.
Трансгенные побеги можно умножить за счет распространения in vitro, что приводит к десяткам побегов в течение месяца. Эти побеги могут быть размещены на укоренения среды, которые будут вызывать образование корней примерно через две недели и урожайность растений, которые могут быть использованы для экспериментов. При запуске стабильного эксперимента по трансформации важно выбрать здоровые ветви в качестве исходного материала.
Параспония T0 трансгенных линий распространяются в пробирке. Поэтому необходимо тщательно генотипить трансгенных линий Параспонии. Создание Параспонии в качестве экспериментальной модели позволяет провести сравнительный анализ между двумя отдаленно связанными кинулирующими линиями, Параспонией и бобовых.
Это может определить сохранение генетических сетей, лежащих в основе симбиоза корневища. Параспония также может быть ценной моделью для изучения других тем исследований, таких как деревообразование, развитие бисексуальных цветов, или биосинтез Каннапаси конкретных вторичных метаболитов.
