Мы разработали строгий метод изоляции клеток от грудного молока человека для изучения антител зависимого клеточного фагоцитоза, или ADCP, фагоцитами грудного молока против целей ВИЧ. Этот метод облегчает относительно быструю и легкую изоляцию клеток грудного молока для оценки способности популяций лейкоцитов выполнять АДКП. Демонстрацией процедуры будет Алиса Фокс, техник из моей лаборатории.
После выбора соответствующего целевого антигена используйте коммерческий комплект для биотинилатного белка, представляющих интерес в соответствии с протоколом производителя. И отмести биотинилированный образец в верхнюю камеру спиновой колонки. Добавьте PBS до 400 микролитров и крышка камеры перед вставкой колонки в трубку сбора для центрифугации.
После отбрасывания потока через, добавить PBS до 400 микролитров для второй центрифугации. Отбросьте поток через, добавить PBS до 400 микролитров, и измерить концентрацию белка с помощью спектрофотометра, чтобы спрягать биотинилированный белок в микросферы микрометра. Инкубировать шесть микрограммов белка с 12 микролитров бульона в 200 микролитров PBS на тарелку спряженных бусин при комнатной температуре в течение двух часов, с нежным вихрем каждые 20 минут.
В конце инкубации, гранулы белка конъюгированных бусин центрифугации и отказаться от супернатанта. После нежного вихря, повторное потребление белка в 1200 микролитров 0,1%BSA в PBS, и мыть трубку центрифугации еще в два раза, как только что продемонстрировали. После последней стирки, повторно гранулы в 1200 микролитров в PBS плюс BSA.
Для настройки ADCP Assay Плиты, сначала подготовить 12 микролитер разбавления антител, или иммунной сыворотки интереса, в 2%BSA в PBS в круглом нижней 96 хорошо пластины. Добавьте 10 микролитров протеиновых конъюгированных бусинок на колодец в течение двух часов инкубации при 37 градусах цельсия. В конце инкубации добавьте 200 микролитров PBS плюс BSA.
После получения грудного молока человека от здоровых кормящих женщин, выражают с помощью насоса, в течение четырех часов выражения отделить содержание молока центрифугации и тщательно слить обезжиренное молоко и жир, оставляя гранулы клетки нетронутыми. Протрите внутреннюю часть трубки с ворсинки, свободной от салфетки, чтобы удалить весь жир из трубки стенки и добавить 10 миллилитров PBS плюс HSA. Повторное подвесной гранулы с нежным пипетки, чтобы избежать активации клеток в апоптоз, и передать клеточной подвески на 15 миллилитров трубки для центрифугации.
После второй стирки в PBS плюс HSA, как только что продемонстрировано, мягко повторного перерасхода клеток в один-два миллилитров свежих PBS плюс HSA для подсчета голосов. Для ADCP Assay, быстро инвертировать подготовленные пластины ADCP, чтобы декантировать супернатант после окончательного центрифугации и добавить пять раз 10 на четвертом свежеисполнимых клеток грудного молока в 200 микролитров PBS плюс BSA в течение двух часов инкубации при 37 градусов по Цельсию. В конце инкубации центрифуга клетки и мыть гранулы два раза в 200 микролитров свежих PBS, как попродемонстрировано.
После последней стирки, пятно клеток с 0,5 микрограмма на миллилитр фиксации жизнеспособности пятно 450 на колодец в 50 микролитров PBS в течение 30 минут при комнатной температуре, защищены от света. В конце инкубации гранулы клеток в течение двух моет в свежем PBS, как попродемонстрировано, и пятно клеток для лейкоцитов маркеры интереса в течение 30 минут при комнатной температуре, защищены от света. В конце инкубации, собирать центрифугации клеток, и мыть клетки два раза в 200 микролитров 1%BSA плюс PBS за стирку.
После последней стирки, исправить гранулы в 200 микролитров 0,5%формальдегида на колодец в течение 30 минут при комнатной температуре, защищены от света. Для цитометрического анализа потока образцов клеток установите цитометр потока, оснащенный высокопроницаемым считывателем пластин, чтобы снять 175 микролитров образца и собрать 5000 клеток на колодец. Выполните первоначальный gating для устранения дублетов и мусора на вперед рассеяния по сравнению с боковой участок рассеяния.
Используйте боковой рассеяния против жизнеспособности пятно участок для устранения мертвых клеток. И использовать боковой рассеяния по сравнению с CD45 участок дифференцировать основные классы лейкоцитов. Для всех CD45 положительных клеток, или для каждого подмножества лейкоцитов интерес, мера антитела зависимых клеточных фагоцитоз деятельности путем gating с маркером на бисер положительные клетки в гистограмме соответствующего канала флюорофора для спряженных бусин.
Затем вычислить антитела зависимых клеточных фагоцитоз оценки, как медиана флуоресценции интенсивности бисера положительных клеток на процент от общего CD45 плюс клетки в положительной популяции. Здесь показана стратегия вымывания дублетов, мусора и мертвых клеток. От одного до 12% от общего числа живых клеток, как правило, CD45 положительные лейкоциты с большинством предполагаемых бокового рассеяния от низкого до промежуточного CD45 низких моноцитов, как представляется, предшественники, или незрелые клетки, на основе бокового рассеяния по сравнению с CD45 gating.
Предполагаемые гранулоциты определяются как боковые рассеяния высоких, CD45 промежуточных клеток. Измерение активности ADCP свежеиспользуемых клеток грудного молока с использованием ВИЧ-специфического человеческого моноклонального антитела в течение одного месяца после родов показывает, что лечение актином ингибитором Cytochalasin D и или рецептором Fc, блокирующим антитела до инкубации с антителами связанных антигена в сочетании с бисером, приводит к активности ADCP на уровне или ниже, что наблюдается в присутствии контроля антител. Оценка ADCP, определяемая для общего количества положительных клеток CD45, обычно составляет от 25 до 35 раз выше фоновых уровней, определяемых с помощью отрицательного контроля, моноклональных антител против сибирской язвы.
Каждый образец грудного молока уникален, и некоторые гранулы могут быть трудно увидеть. Кроме того, популяции лейкоцитов, и, следовательно, оценки ADCP, могут сильно варьироваться от выборки к образцу.
