Hiv hedeflerine karşı anne sütü fagositleri ile antikorbağımlı hücresel fagositis veya ADCP'yi incelemek için insan sütünden hücreleri izole etmek için titiz bir yöntem geliştirdik. Bu teknik, lökosit popülasyonlarının ADCP yapma kapasitesini değerlendirmek için anne sütü hücrelerinin nispeten hızlı ve kolay izolasyonuna yardımcı olur. Prosedürü gösteren Alisa Fox, benim laboratuvar bir teknisyen olacaktır.
İlgili bir hedef antijen seçtikten sonra, üreticinin protokolüne göre ilgi proteinbiyotinylate ticari bir kit kullanın. Ve biyotinylated örneği bir spin sütununun üst odasına yatırın. 400 mikrolitreye kadar PBS ekleyin ve kolonsantrifüj için bir toplama tüpü içine eklemeden önce haznekapağı.
Akışı attıktan sonra, ikinci bir santrifüj için 400 mikrolitreye PBS ekleyin. Akışı atın, 400 mikrolitreye PBS ekleyin ve biyotinylated proteini mikrosferlere ayırmak için bir spektrofotometre ile protein konsantrasyonu ölçün. Oda sıcaklığında iki saat boyunca konjuge boncuk tabağı başına 200 mikrolitre PBS'de 12 mikrolitre stok boncuk la birlikte altı mikrogram protein inkübün.
Kuluçka sonunda, santrifüj ile protein konjuge boncuk pelet ve supernatant atın. Nazik girdap sonra, PBS 0.1% BSA 1200 mikrolitre protein resuspend, ve santrifüj ile tüp yıkayın iki kez daha az gösterdiği gibi. Son yıkamadan sonra, PBS artı BSA 1200 mikrolitre pelet resuspend.
ADCP Tahsna Levhaları kurmak için, ilk yuvarlak bir alt 96 iyi plaka PBS% 2 BSA antikor veya ilgi bağışıklık serum12 mikrolitre seyreltme hazırlamak. 37 santigrat derecede iki saatlik kuluçka için plakaya iyi başına protein konjuge boncuk 10 mikrolitre ekleyin. Kuluçka sonunda, PBS artı BSA 200 mikrolitre ekleyin.
Sağlıklı emziren kadınlardan insan sütü aldıktan sonra pompa kullanarak ifade, ifade dört saat içinde santrifüj ile süt içeriğini ayırmak ve dikkatle yağsız süt ve yağ dökün, hücre pelet rahatsız bırakarak. Tüpün içini tüy bırakmayan bir mendille silin ve tüm yağları tüp duvarından çıkarın ve 10 mililitre PBS artı HSA ekleyin. Apoptozda hücre aktivasyonunu önlemek için peleti nazik pipetleme ile yeniden askıya alın ve santrifüj için hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.
PBS artı HSA'da ikinci bir yıkamadan sonra, bir ila iki mililitre taze PBS artı HSA'daki hücreleri saymak için yavaşça yeniden askıya alın. Bir ADCP Tahlil için, hızlı bir şekilde son santrifüj sonra supernatant decant hazırlanan ADCP plaka ters ve pbs artı BSA 200 mikrolitre dördüncü taze izole anne sütü hücrelerinde beş kez 10 eklemek 37 santigrat derece iki saatlik kuluçka için. Kuluçka sonunda, hücreleri santrifüj ve taze PBS 200 mikrolitre iki kez pelet yıkama.
Son yıkamadan sonra, hücreleri mililitre başına 0,5 mikrogram sabitlenebilir canlılık lekesi ile lekeleyin 50 mikrolitre PBS'de 50 mikrolitre de ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dakika boyunca. Kuluçka sonunda, gösterildiği gibi taze PBS iki yıkama hücreleri pelet, ve oda sıcaklığında ilgi lökosit belirteçleri için hücreleri leke, ışıktan korunan. Kuluçka sonunda, hücreleri santrifüj toplamak ve yıkama başına% 1 BSA artı PBS 200 mikrolitre iki kez hücreleri yıkayın.
Son yıkamadan sonra, peletleri 200 mikrolitrede, her kuyu başına %0,5 formaldehit halinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca, ışıktan korunan şekilde düzeltin. Hücre örneklerinin akış sitometrik analizi için, 175 mikrolitre numune çekmek ve kuyu başına 5000 hücre toplamak için yüksek iş leme plaka okuyucusuyla donatılmış bir akış sitometreayarlayın. İleri dağılım ayarı ve yan dağılım çiziminde çift ekibe ve enkazı ortadan kaldırmak için ilk gating'i gerçekleştirin.
Ölü hücreleri ortadan kaldırmak için canlılık leke arsa karşı bir yan dağılım kullanın. Ve büyük lökosit sınıfları ayırt etmek için CD45 arsa karşı bir yan dağılım kullanın. Tüm CD45 pozitif hücreler için, ya da ilgi her lökosit alt kümesi için, konjuge boncuklar için uygun florofor kanalının bir histogramboncuk pozitif hücrelerin üzerinde bir belirteç ile gating tarafından antikor bağımlı hücresel fagositoz aktivitesini ölçmek.
Daha sonra toplam CD45 artı pozitif popülasyondaki hücrelerin yüzdesi ile boncuk pozitif hücrelerin floresan yoğunluğunun ortanca olarak antikor bağımlı hücresel fagositoz puanları hesaplamak. Burada, doublets, enkaz ve ölü hücreleri ortadan kaldırmak için gating stratejisi gösterilir. Toplam canlı hücrelerin %1 ila %12'si tipik olarak CD45 pozitif lökositlerdir ve sözde yan dağılımların çoğu düşük ila orta CD45 düşük monositler öncül olarak görünen veya cd45 gating'e karşı yan dağılıma dayalı olgunlaşmamış hücrelerdir.
Sözde granülositler yan dağılım yüksek, CD45 ara hücreler olarak tanımlanır. Bir ay postpartumda HIV spesifik insan monoklonal antikor kullanarak yeni izole anne sütü hücrelerinin ADCP aktivitesinin ölçümü, antibody bağlı antijen ile kuluçka dan önce aktin inhibitörü Sitokasin D ve fc reseptör bloke antikorları ile tedavi nin kontrol antikor varlığında gözlenen ADCP aktivitesi veya altında ADCP aktivitesi ile sonuçlandığını ortaya koymaktadır. Toplam CD45 pozitif hücreler için belirlenen ADCP skoru genellikle arka plan düzeylerinin 25 ila 35 kat üzerindedir, negatif kontrol, anti-şarbon monoklonal antikor kullanılarak tanımlanır.
Her anne sütü örneği benzersizdir ve bazı peletleri görmek zor olabilir. Buna ek olarak, lökosit popülasyonları ve bu nedenle ADCP skorları örnekten örneğe son derece farklılık gösterebilir.
