우리는 HIV 표적에 대하여 모유 phagocytes에 의하여 항체 의존적인 세포 phagocytosis, 또는 ADCP를 공부하기 위하여 인간 적인 모유에서 세포를 격리하는 엄격한 방법을 개발했습니다. 이 기술은 ADCP를 수행하기 위해 백혈구 집단의 용량을 평가하기 위해 모유 세포의 비교적 빠르고 쉬운 격리를 용이하게합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 기술자 인 알리사 폭스 (Alisa Fox)가 될 것입니다.
관련 표적 항원을 선택한 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 관심 있는 단백질을 생체화하기 위해 상용 키트를 사용합니다. 그리고 바이오티니드 샘플을 스핀 컬럼의 상부 챔버에 증착한다. PBS를 최대 400마이크로리터를 추가하고 원심분리를 위해 컬럼을 수집 튜브에 삽입하기 전에 챔버를 캡합니다.
흐름을 폐기한 후 PBS를 400마이크로리터에 추가하여 두 번째 원심분리를 합니다. 흐름을 버리고, 400 마이크로리터에 PBS를 추가하고, 분광계에 의한 단백질 농도를 측정하여 생체화 단백질을 마이크로미터 마이크로스피어에 수렴한다. 20분마다 부드러운 소용돌이와 함께 2시간 동안 실온에서 컨쥬게이트 구슬 당 PBS 200 마이크로리터200 마이크로리터에 12 마이크로리터의 스톡 비드를 장착한 6마이크로그램의 단백질을 배양합니다.
인큐베이션의 끝에서, 단백질은 원심분리에 의해 구슬을 컨쥬게이징하고 상퍼를 버린다. 부드러운 소용돌이 후, PBS에서 0.1 %의 BSA의 1200 마이크로 리터에서 단백질을 다시 중단하고, 단지 입증된 바와 같이 원심 분리에 의해 튜브를 두 번 더 세척합니다. 마지막 세척 후, PBS 플러스 BSA에서 1200 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단.
ADCP 분석판을 설정하려면 먼저 12개의 마이크로리터 희석제 또는 관심있는 면역 혈청을 PBS에서 2%BSA로 라운드 하단 96 웰 플레이트로 준비한다. 37°C에서 2시간 동안 접시에 잘 섞인 단백질 구슬 10마이크로리터를 첨가합니다. 인큐베이션이 끝나면 PBS 플러스 BSA의 200 마이크로리터를 추가합니다.
펌프를 사용하여 표현하는 건강한 수유 여성으로부터 인간의 모유를 얻은 후, 발현 4 시간 이내에 원심 분리에 의해 우유 내용을 분리하고 조심스럽게 탈지 우유와 지방을 부어 세포 펠릿을 방해받지 않고 둡시. 튜브 벽을 완전히 제거하고 PBS 플러스 HSA의 10 밀리리터를 추가하기 위해 보풀이없는 와이프로 튜브 내부를 닦으십시오. 팔버토시스에서 세포 활성화를 피하기 위해 부드러운 파이펫팅으로 펠릿을 다시 중단하고, 세포 현탁액을 원심분리를 위한 15 밀리리터 튜브로 옮긴다.
방금 입증 된 바와 같이 PBS 플러스 HSA에서 두 번째 세척 후, 부드럽게 계산에 대한 신선한 PBS 플러스 HSA의 1 ~ 2 밀리리터에 세포를 다시 중단. ADCP 분석의 경우, 준비된 ADCP 플레이트를 신속하게 반전하여 최종 원심분리 후 상체를 감소시키고 PBS 의 200 마이크로리터에 4번째로 새로 분리된 모유 세포에 5회 10번을 추가하여 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 세포를 원심분리하고 입증된 바와 같이 신선한 PBS의 200 마이크로리터에서 두 번 펠릿을 세척한다.
마지막 세척 후, 실온에서 30 분 동안 PBS의 50 마이크로 리터에 잘 당 450 고정 생존성 스테인의 밀리리터 당 0.5 마이크로 그램으로 세포를 얼룩, 빛으로부터 보호. 인큐베이션의 끝에서, 입증된 바와 같이 신선한 PBS에서 두 개의 세척세포를 펠렛하고, 실온에서 30분 동안 관심 있는 백혈구 마커에 대한 세포를 얼룩지게 하여 빛으로부터 보호한다. 인큐베이션의 끝에서, 세포 원심분리를 수집하고, 세척당 1%BSA 플러스 PBS의 200 마이크로리터에서 세포를 두 번 세척한다.
마지막 세척 후, 200 마이크로리터의 0.5% 포름알데히드의 200 마이크로리터에 체온으로부터 30분 동안 고정하여 빛으로부터 보호합니다. 세포 샘플의 유동 세포 측정 분석을 위해, 고처리량 플레이트 판독기가 장착된 유동 세포계를 설정하여 175마이크로리터의 시료를 인출하고 우물당 5000세포를 수집한다. 측면 분산 플롯대 전방 산란에 이중및 이물질을 제거하기 위해 초기 게이팅을 수행합니다.
죽은 세포를 제거하기 위해 생존 성 얼룩 플롯 대 측면 산란을 사용합니다. 그리고 주요 백혈구 클래스를 구별하기 위해 CD45 플롯 대 측면 산란을 사용합니다. 모든 CD45 양성 세포또는 각 백혈구 하위 집합에 대해, 공주비에 대한 적절한 플루오로포어 채널의 히스토그램에서 비드 양성 세포에 마커로 게이팅하여 항체 의존성 세포 식세포 활성을 측정한다.
그런 다음 항체 의존성 세포 phagocytosis 점수를 비드 양성 세포의 형광 강도의 중앙값으로 총 CD45의 백분율로 계산하고 양성 집단의 세포를 더하였다. 여기서는 이중, 파편 및 죽은 세포를 제거하기위한 게이팅 전략이 표시됩니다. 총 살아있는 세포의 1~12%는 전형적으로 CD45 양성 백혈구이며, 대부분의 의도적인 측면은 구체체로 나타나는 낮은 CD45 낮은 단백세포또는 CD45 개팅 대 측면 산란에 기초하여 미숙한 세포로 산란된다.
의도적인 과립구는 측면 산란 높은, CD45 중간 셀로 정의된다. 한 달 산후에서 HIV 특정 인간 단일 클론 항체를 사용하여 갓 분리 된 모유 세포의 ADCP 활성을 측정하면 항체 바운드 항원 결합 비드가 있는 배양 전에 액틴 억제제 Cytochalasin D 및 또는 Fc 수용체차단 항체를 사용한 치료가 대조항체의 존재에서 관찰된 ADCP 활성을 초래한다는 것을 알 수 있습니다. 총 CD45 양성 세포를 위해 결정된 ADCP 점수는 일반적으로 배경 수준 보다 25~35배 사이이며, 음의 대조군, 항탄트락스 단일클론 항체를 사용하여 정의된다.
모든 모유 샘플은 고유하며 일부 펠릿은 보기 어려울 수 있습니다. 또한 백혈구 인구, 따라서 ADCP 점수는 샘플에서 샘플마다 엄청나게 다를 수 있습니다.
