Мы пытаемся открыть новые виды химии для борьбы с сельскохозяйственными патогенами. Используя технологию iChip, мы выделили новые организмы, которые, как мы надеемся, приведут к созданию новой химии. Тестирование этих организмов и/или их природных продуктов против сельскохозяйственных патогенов потенциально может привести к обнаружению новых организмов и/или соединений-кандидатов на биопестициды.
Метод iChip позволяет нам изолировать микроорганизмы, которые не поддаются культивированию в обычных условиях, обеспечивая период одомашнивания и контакта с их естественной средой. Наша модифицированная конструкция iChip проста, недорога и снижает риск микробного загрязнения, что делает его легко доступным для различных исследовательских целей. Результаты iChip открывают вопросы о том, какие механизмы управляют подавлением патогенов новыми микробами?
Могут ли эти биологически активные соединения надежно работать в реальных испытаниях? Как факторы окружающей среды влияют на их эффективность? Решение этих вопросов будет способствовать устойчивой разработке биопестицидов, преобразованию борьбы с болезнями растений и снижению зависимости от синтетических фунгицидов.
Лаборатория будет применять технологию iChip для выделения новых бактерий из почв, подавляющих болезни, полученных в результате выращивания покровных культур, выявляя новые микробы и биологически активные соединения. Они будут протестированы в исследованиях контролируемых болезней растений для разработки инновационных, устойчивых альтернатив синтетическим фунгицидам для борьбы с сельскохозяйственными болезнями. Чтобы создать модифицированный iChip с помощью 5-миллиметрового агарового пробивного инструмента, удалите дно лунок с 96-луночной пластины.
Разрежьте поликарбонатные мембраны толщиной 0,05 микрометра на прямоугольники, убедившись, что размеры соответствуют площади дна 96-луночного планшета. Нанесите силиконовый герметик, чтобы приклеить поликарбонатную мембрану к дну 96-луночной пластины. Убедитесь, что клей герметизирует лунки, но не полностью закрывает отверстия лунок.
Дайте пластинам высохнуть в течение 24 часов. Добавьте 4,5 миллилитра стерильной воды в каждую из 15-миллилитровых центрифужных пробирок с маркировкой от A до D, и в каждую из 50-миллилитровых пробирок с маркировкой от E до H. Добавьте 1 грамм почвы в 50-миллилитровую центрифужную пробирку. Затем добавьте в тюбик 10 миллилитров воды и вортите смесь в течение 10 минут.
Дайте почвенной взвеси осесть в течение 10 минут. Далее пипеткой пипетку 0,5 миллилитра грунта надосадочной жидкости в пробирку А и тщательно перемешайте. Теперь перенесите 0,5 миллилитра клеточной суспензии из пробирки А в пробирку Б и тщательно перемешайте.
Повторите то же самое для всех остальных пробирок центрифуги, завершив серию десятикратных разведений по восьми пробиркам. Для начала полностью погрузите чипы iChips в 95% этанол. Через 15 минут извлеките пластины из этанола и поместите их на стерильное бумажное полотенце в вытяжку с ламинарным потоком.
Дайте этанолу испариться во время включения ультрафиолетового стерилизатора в вытяжке с ламинарным потоком на 15 минут. Пипеткой 360 мкл стерильного сукцината с минимальным содержанием солей или СМС сред в первую колонку планшета послужит контрольной. Добавьте 45 миллилитров SMS в клеточную суспензию в пробирке E.Тщательно перемешайте, чтобы соединить клеточную суспензию с агаром.
Пипеткой внесите 360 микролитров смеси агаровых клеток во все оставшиеся лунки 96-луночного планшета. После того, как носитель будет схватываться, запечатайте верхнюю часть планшета крышкой для планшета PCR. Заполните пластины с помощью пробирок F, G и H, чтобы получить в общей сложности четыре пластины с десятикратной разницей в концентрациях.
Поместите пластины в контейнер, содержащий примерно 1 дюйм почвы, стороной мембраны вниз. Инкубируйте пластины внутри закрытой емкости в темноте при температуре 25 градусов Цельсия. Через шесть недель осмотрите чипы iChips на предмет роста микроорганизмов.
Трижды промойте модифицированный чип стерильной водой, чтобы удалить все частицы почвы. Протрите верхнюю и боковые стороны пластины 95% этанолом, избегая стороны с полупроницаемой мембраной. С помощью стерильного лезвия разрежьте крышку пластины вокруг лунки, содержащей колонию, и удалите квадрат стерильным пинцетом.
С помощью стерильного инструмента для полос проткните колонию и нанесите полосу на пластину агара SMS методом четырех квадрантов. Инкубируйте планшеты при температуре 25 градусов Цельсия в течение одной недели или до тех пор, пока не будет наблюдаться рост колонии. После инкубации осмотрите колонии, чтобы подтвердить выделение культур.
