Мы разработали монтажный метод для изображений замедленного действия, который позволяет неограниченный рост хрупких эмбрионов зебры и в то же время держит их в совершенно фиксированном положении. Этот метод монтажа быстрый, простой и дешевый, и он работает для лабораторных изображений на любом перевернутом микроскопе. Мы разработали этот метод для визуализации живых эмбрионов зебры, но он может быть изменен для изображения других небольших моделей водных животных.
Начните с разведения взрослых зебры. Во второй половине дня поместите рыбу в резервуары для размножения при соотношении мужчин и женщин от одного до двух. Затем приготовьте раствор бульона 1%low melt agarose в эмбриональных средствах массовой информации и растворите его, нагревая его в микроволновой печи.
Aliquot раствор агарозы в 1,5 миллилитровые трубки. Сделать фондовый раствор 4%tricaine в дистиллированной воде и хранить агарозу и трикаин при четырех градусах по Цельсию. Tricaine является токсичным и должен быть взвешен и подготовлен в дым капот.
После спаривания, урожай эмбрионов зебры в E3 в чашке Петри и инкубировать их при 26,5 градусов по Цельсию в течение 28 часов до монтажа. Анестезировать эмбрионы с 0,02%tricaine и дехорионат их под микроскопом, мягко захвата и потянув хорион друг от друга, чтобы освободить эмбрион. Перед монтажом нагрейте раствор агарозы до 65 градусов по Цельсию, а затем дайте ему остыть примерно до 30 градусов по Цельсию, чтобы эмбрион не пострадал от жары и добавить трикаин в раствор агарозы.
Используйте 35-миллиметровые стеклянные нижние блюда с нулевым дном крышки. Аккуратно поместите деторионированный эмбрион с одной из боковых сторон к нижней части блюда стеклянной пипеткой или микропипетом, затем аккуратно удалите оставшийся E3 с помощью микропипеда. Добавьте первый раствор агарозы в небольшой колодец, созданный стеклом, прикрепленным к нижней части блюда, чтобы покрыть эмбрион, убедившись, что агароза покрывает небольшой колодец, но не переполняет его.
Обложка небольшой колодец с стеклом для создания узкой агарозы заполненные пространства с эмбрионом между двумя coverglasses. Поместите слой раствора 1%agarose поверх стекловолокна по всей нижней части блюда, которое будет держать стекло на месте, как он затвердевает. Затем заполните оставшуюся часть блюда с E3, содержащий 0,02%tricaine держать систему гидратированных.
Чтобы определить оптимальную концентрацию агарозы для первого слоя, смонтировать эмбрионы в возрастающей концентрации агарозы и выполнить промежуток времени изображения для определения концентрации, которая сводит к минимуму искажение эмбриона и подвижность, а затем проверить более тонкий диапазон концентраций на основе результатов. Наиболее важным шагом этого протокола является определение оптимальной концентрации агарозы для слоя один. Проверьте различные концентрации нано агарозы, такие как 0.030%0.032%etc.
чтобы найти оптимальную концентрацию. Для выполнения замедленной визуализации эмбрионов используйте стадию микроскопа с инкубатором, установленный до 28,5 градусов по Цельсию, и изображением на срок до 55 часов. Чтобы одновременно изображение нескольких эмбрионов, использовать этап адаптер, который держит несколько блюд и вращать посуду один за другим, так что эмбрионы горизонтально расположены.
Выберите цель низкого увеличения, затем найдите эмбрионы с помощью окуляра и, наконец, выровнять их горизонтально, вращая посуду. Замеская местоположение эмбрионов в программном обеспечении и создайте имя файла для автоматического хранения данных. Установите размер пинхол, скорость сканирования, размер изображения и масштабирование.
Затем выберите более высокое увеличение для захвата изображений и каналов флуоресценции, которые будут изображены. Для каждого канала, настроить мощность лазера и детектор высокого напряжения убедившись, что собрать лучший динамический диапазон возможно, избегая при этом насыщения и ограничения отбеливания фотографий. Далее, чтобы изображение всего эмбриона с целью 10X, установить большие настройки захвата изображения в программном обеспечении для изображения нескольких полей зрения и сшить их вместе корректировки положения эмбриона, чтобы убедиться, что он вписывается в эту большую область изображения.
Настройте настройки для захвата стеков в соответствии с рукописными указаниями. Для того, чтобы сохранить фокус нескольких эмбрионов во время долгосрочной покадровой визуализации, используйте автоматизированный фокус и отрегулируйте индивидуальные уровни смещения для каждого эмбриона, чтобы сосредоточиться на эталонной плоскости. Затем на настройку параметров замедленного действия в программном обеспечении микроскопа для изображения в течение 55 часов с интервалом в один час.
На каждом цикле последовательно захватывать два набора данных эмбрионов и автоматически экономить данные. Используйте программное обеспечение микроскопа для обработки изображений. Если было изображено несколько эмбрионов, создайте независимые файлы для каждого эмбриона, разделив наборы данных в зависимости от местоположения изображения.
Преобразование наборов данных 3D-времени в наборы данных 2D-времени с использованием проекций максимальной интенсивности или аналогичного инструмента. Наконец, создайте файлы фильмов, сохранив в качестве AVI и выбрав опцию без сжатия с интервалом в 200 миллисекунд для скорости воспроизведения в пять кадров в секунду. Этот многоуровневый метод монтажа позволяет изображение эмбрионов зебры, позволяя им расти, но в то же время ограничивая их движение.
Если концентрация агарозы слишком высока, эмбрионы искажаются. Но если она слишком низкая, они будут выходить из поля зрения во время покадровой микроскопии. Оптимальная концентрация агарозы была обнаружена между 0,028 и 0,034%Live трансгенных зебры, выражают RFP во всем эмбрионе и GFP в эндотелиальных клетках сосудов были изображены в течение 55 часов, в течение которых межшементальный сосуд пророс, подкишечные и головные сосуды разработаны, и хвостовой вены сплетения с расширением ствола произошло.
Эмбрионы, выражаюющие GFP и моторные нейроны, были изображены для визуализации развития моторных нейронов. Моторные нейронные аксоны прорастают из брюшной нервной трубки над сомитами к брюшной стороне эмбриона. Совместное развитие спинного прорастания аксонов моторных нейронов по отношению к положению межсекментальных сосудов было изображено с помощью более высокого увеличения.
Это сделало возможным визуализировать более тонкие детали прорастания брюшного аксона, а также прорастания спинного аксона из нервной трубки. По мере увеличения числа сомитов, сомиты также простираются в длину и ширину. Этот процесс был изображен с помощью трансгенных эмбрионов, выражаюющих GFP в мышцах.
Поскольку оптимальная концентрация агарозы очень узкая, она очень чувствительна к небольшим колебаниям измерений при подготовке биржевого раствора агарозы и нуждается в пересмотре для каждой новой партии раствора агарозы. Важно тщательно установить параметры изображения, включая размер изображения и разрешение, скорость сканирования, зум, детектор высокого напряжения и мощность лазера, чтобы обеспечить согласованность между экспериментами, а также уменьшить возможность токсичности фото и отбеливания фотографий во время долгосрочной покадровой визуализации. Используя этот монтажный метод для трансгенных эмбрионов зебры с последующим расширенным сроком визуализации всего организма, мы можем визуализировать, как различные ткани развиваются вместе.
