Этот метод может помочь ответить на фундаментальные вопросы о динамике нейронных клеток-предшественников и их потомства, которые лежат в основе развития позвоночного мозга. Основным преимуществом этого метода является возможность непосредственно визуализировать несколько кластеров клонально связанных клеток в живом мозге в течение многих часов развития. Протокол также может быть применен к изучению динамики клонов и прародителя в других развивающихся системах эмбриона зебры.
Визуализация с помощью этого метода особенно полезна для непосредственного наблюдения за фундаментальными процессами, которые происходят во время развития нервной системы. Во второй половине дня перед выполнением микро-инъекций, создать дикий тип взрослых зебры в секс сегрегированных брачных резервуаров. На следующее утро подготовь решение ДНК в соответствии с рукописными указаниями и впрыснут примерно 4,2 нанолитров этого раствора в одноклеточные эмбрионы зебры в течение 45 минут после оплодотворения.
Поддерживайте вводимые эмбрионы в E три средних и 28 градусов по Цельсию инкубатор в течение 24 часов, а затем вызвать мертвых и деформированных эмбрионов из группы. Перенесите до 20 здоровых эмбрионов в 50 миллилитровую трубку, заполните ее 10 миллилитров E 3 и поместите крышку поверх каждой трубки. Поместите стойку с 50 миллилитров трубами вертикально в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 80 до 90 минут, убедившись, что уровень воды в ванне выше, чем E три в трубке.
Снимите стойку трубки с водяной ванны и поместите ее в инкубатор 28 градусов по Цельсию. Разрешить до одного часа для E три остыть и эмбрионов, чтобы reacclimate к температуре. Затем перенесите их в чашки Петри с 0,2 миллимолярем PTU и E три хранится тепло в 28 градусов по Цельсию инкубатора.
Через два-четыре часа после теплового удара, изучить эмбрионы под стандартным микроскопом вскрытия флуоресценции для выражения CFP или YFP, который указывает на успешную рекомбинацию Brainbow. Выберите эмбрионы с надежным выражением FP во всем и передать их в отдельное блюдо с PTU. Изображение их один, два или три дня после оплодотворения.
Выражение, которое появляется тусклый под флуоресценции микроскопа может быть на самом деле хорошо визуализированы в конфокальных промежуток времени изображения. Перед днем эксперимента подготовьтесь к камере визуализации и инструменту манипуляции эмбрионами. Чтобы подготовить камеру визуализации, тщательно надклейте пластиковое кольцо к центру 60-миллиметровой чашки Петри.
Построить манипулятор, супер склеивания небольшой длины нейлоновой лески до конца четыре дюйма деревянной палкой тампона. При необходимости дехорионировать эмбрионы под микроскопом вскрытия до монтажа. Чтобы смонтировать эмбрионы, перенесите рыбу в центр пластикового кольца в камере визуализации и удалите как можно больше избытка E три, как это возможно с тонкой наконечником передачи пипетки.
Используйте чистую трубу передачи для покрытия рыбы с одним процентом низкого расплава агарозы и E три, заполняя все пластиковое кольцо слоем агарозы. Затем аккуратно потяните эмбрион вверх в кончик пипетки и обратно в агарозу, не вводя пузырьков воздуха. Используйте манипулятор эмбриона, чтобы быстро сориентировать рыбу и агарозу, прежде чем она затвердеет.
Если изображение с вертикальным микроскопом, положение эмбриона как можно ближе к верхней поверхности агарозы, насколько это возможно, убедившись, что они параллельны нижней части камеры изображения с хвостом прямо. Подождите, пока агароза затвердеет, а затем заполнить камеру визуализации с E три, добавив как можно больше для учета испарения в течение изображения. Поместите камеру визуализации с рыбой и E 3 на конфокальный микроскоп.
Затем выберите цель с высокой численной диафрагмой и большим рабочим расстоянием. Найдите область с соответствующей плотной и яркой маркировкой ячеек и найдите параметры приобретения. Это пример с помощью программного обеспечения Дзэн, но настройки будут варьироваться в зависимости от микроскопа и лазерных линий.
Подготовка трех треков для изображения каждого канала FP последовательно. Используйте аргон лазер для возбуждения CFP на 458 нанометров и YFP на 514 нанометров, и использовать лазер DPSS 561 нанометров, чтобы возбудить dTomato. Соберите миссии для трех на соответствующих длинах волн.
Выберите диапазон стеков для изображения и интервал времени от 10 до 30 минут для отслеживания митотических и апоптотических событий. Наконец, выберите длину сеанса визуализации и запустите эксперимент. После завершения визуализации сохраните необработанные данные в формате ЦЗИ при использовании Дзэн или другого формата, совместимого с Фиджи, а затем импортируют изображения на Фиджи с помощью импортера биоформатов.
In vivo многоцветная покадровая визуализация была использована, чтобы показать Brainbow цветные клоны клеток в пролиферативной желудочковой зоне развивающегося заднего мозга зебры. Brainbow помечены клетки расположены вдоль конкретного радиального волокна разделяют тот же цвет. Которые могут быть количественно, как относительные веса канала RGB.
Это говорит о том, что эти радио группы были клонами разделительных клеток и что их аналогичный цвет может быть использован для идентификации их как клонально связанных. Количественный цветовой анализ показал, что клетки дочери выражают тот же цвет, что и клетка их матери. Но что соседние радиокластеры клеток можно отличить друг от друга.
Многочисленные клоны родственных клеток могут следовать одновременно в течение нескольких часов in vivo, что позволяет проводить анализ и сравнение линии мультиплекса. Количественная оценка цветного выражения в клонах в два, а затем снова на три дня после оплодотворения показала, что выражение Brainbow оставалось относительно постоянным от двух до трех дней. Промежуток времени показал, что многие клетки проходят межкинетическую ядерную миграцию и деление клеток от одного до двух дней после оплодотворения, что позволяет изучать клеточный цикл.
Был рассчитан средний клеточный цикл продолжительности 8,4 часа, что сопоставимо с предыдущими измерениями у зебры. Кроме того, этот метод визуализации был использован для наблюдения отдельных клеток, претерпевающих стереотипные морфологические изменения, связанные с апоптозом, такие как мембранный блеф и фрагментация клеток. Поскольку этот метод выполняется in vivo, зебрафиш можно спасти из камеры визуализации и поддерживать для визуализации или других экспериментов в более поздних точках времени.
Использование этого метода позволяет нам исследовать новые вопросы о роли клонально связанных клеток во время нейронного развития.
