Наш протокол предназначен для зондирования биофизических механизмов, регулирующих перевозку грузов группами идентичных или противоположно направленных цитоскелетных моторных белков. Используя оригами ДНК для молекулярной конструкции, этот метод может выбрать тип, число и расположение двигателей на точно определенных формах груза. В то время как этот протокол фокусируется на микротрубочках на основе двигателей динейна и кинезин, он адаптируется к актин основе миозин двигателя, а также к другим белковым системам, которые функционируют совместно.
Одним из сложных аспектов этого протокола является поддержание целостности и активности моторных белков на протяжении всего процесса очистки, так как они чувствительны к тепловой и механической силе. Чтобы вызвать рост и экспрессию моторного белка через промоутер галактозы, используйте стерильную палочку прививки, чтобы полоса замороженных дрожжей штамм интереса на дрожжевой пептон-декстроза культуры пластины для трех-четырехдневной инкубации при 30 градусов по Цельсию. На четвертый день культуры, когда оптическая плотность на 600 нанометров составляет от 1,5 до двух, собирать дрожжевые клетки центрифугации, и повторно гранулы в воде, чтобы вымыть их и консолидировать клетки в одной бутылке.
Спин клетки снова для сбора, и повторно гранулы примерно в двух миллилитров двойной дистиллированной воды. Затем используйте 10-миллилитровую пипетку, чтобы медленно распределять клеточный суспензию в жидкий азот по одной капле за раз для производства замороженных гранул дрожжевых клеток. Для очистки моторного белка используйте кофемолку типа лезвия, предварительно охлажденную жидким азотом, чтобы измельчить замороженные дрожжевые гранулы в мелкий порошок и передать дрожжевой порошок в предварительно охлажденный, 100-миллилитровый стеклянный стакан на льду.
Добавьте небольшой объем свежеприготовленного 4X-лиза буфера с добавками к порошку, чтобы окончательная концентрация буфера не превышала 1X, и поместите стакан в 37-градусную ванну с водой по Цельсию с непрерывным перемешиванием шпателем, чтобы быстро разморозить порошок. Добавьте дополнительный буфер 4X с добавками, чтобы довести окончательную концентрацию буфера до 1X в лисате. Окончательный объем часто составляет от 25 до 30 миллилитров.
Затем соберите дрожжевые клетки путем центрифугации и перенесите растворимый белок, содержащий супернатант, в новую 50-миллилитровую коническую трубку на льду. Для очистки сродства IgG добавьте 200 микролитров промытой подвески шарика сродства к экстракту белка и инкубировать смесь при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа с нежным вращением. В конце инкубации, фильтровать смесь через тот же столбец хроматографии используется для подготовки бисера на четыре градуса по Цельсию, а затем два моет с пятью миллилитров мыть буфера на стирку на льду.
После второй стирки, промыть бисер на льду с пятью миллилитров буфера TEV, что позволяет буферу полностью стечь из колонки. Для маркировки олигонуклеотида ДНК крышка колонки хроматографии и инкубировать моторные бусины 100 микролитров буфера TEV, дополненных 10-20 микромоларом очищенного олиго бензилгуанина при комнатной температуре от 10 до 15 минут, аккуратно резуспенсировать бисер раз в минуту. В конце инкубации, мыть бисер четыре раза со свежим буфером TEV за стирку, как только что продемонстрировано, прежде чем повторить нижней части трубки, чтобы повторное успение моторных бусин в не более чем 200 микролитров свежего буфера TEV.
Для расщепления TEV перенесите подвеску моторного шарика на двухми миллилитровую, круглую нижнюю, микроцентрифугированную трубку и инкубировать моторные бусины примерно 0,3 единицами протеазы TEV на микролитр смеси моторного бисера при 16 градусах Цельсия в течение одного часа с нежным вращением. В конце инкубации центрифугают моторные бусины и собирают смесь на дне трубки. Далее, используйте вырезать P1000 пипетки отзыв для передачи смеси в спин колонке, и центрифуга смеси, как только что продемонстрировали.
Соберите фильтрат, содержащий TEV-расщепленные, очищенные двигатели, и aliquot фильтрат в 50-микролитровых томов для микротрубочек сродства очистки. Затем вспышки заморозить aliquots в жидком азоте для минус 80 градусов по Цельсию хранения. Для очистки шасси, во второй половине дня за день до очистки, аккуратно слой 80 микролитров каждый из концентрации глицерола в оригами складной буфер в центрифуге трубки.
Границы между слоями должны быть слегка видны. После ночной инкубации при четырех градусах Цельсия слой 10%глицерола в буфере складывания оригами в сложенном растворе шасси поверх верхнего слоя градиента и центрифуга градиента с шасси. В конце центрифугации соберите 50-микролитровые фракции градиента в направлении сверху вниз и загрузите пять микролитров каждой фракции в отдельные скважины из 2%агарозного геля.
После 90 до 120 минут на 70 вольт, изображение геля с использованием условий, подходящих для ДНК гель пятно используется. Количественные концентрации выбранных фракций интереса могут быть определены с помощью соответствующих стандартных спектроскопических методов. Анализ SDS-PAGE может быть использован для подтверждения успешной извлечения динейна из дрожжей, так как окончательный фильтрат показывает четкую, острую полосу на уровне около 350 килодалтонн.
TEV protease также присутствует в окончательном фильтрате и образует четкую полосу на уровне около 50 килодалтонн. После очистки сродства микротрубочек, dynein появляется как ясная, однодиапазая полоса на 350 килодалтонов, в то время как кинезин можно наблюдать как слегка размазывание, несколько полос около 120 килодальтонов. В дополнение к TEV protease, заметное количество тубулина также можно наблюдать в окончательном supernatant.
Сворачивание структур ДНК оригами может быть просаснуто электрофорезом агарозного геля, с изменением подвижности между чистой развернутой нитью эшафота и складной реакцией, указывающей на складывание оригами. Кроме того, складная реакция указывает на наличие некоторой мультимеризации конструкций шасси. Подвижность моторных ансамблей шасси легко обнаруживается и измерима на кимографах, созданных из фильмов TIRF, так как кимографы гибкого шасси, спряженные до семи динайных белков, демонстрируют высокую процессичность работ на относительно последовательных скоростях.
Очень важно тщательно контролировать температуру моторных белков на каждом этапе процедуры. После очистки моторных белков и шасси оригами ДНК, эти два компонента могут быть спряжены для анализа подвижности ансамблей под микроскопом TIRF. Этот метод позволяет расшифровать биофизические и биохимические механизмы, регулирующие возникающие подвижность моторных ансамблей.
