Этот метод расширяет нанотехнологии ДНК из исходных материалов линейного олигонуклеотида, DAS, в еще несколько круговых DAS. Основные преимущества этих технических являются то, что это простой, надежный и доступный для большинства лабораторий. Для круговой очистки ДНК добавьте 20 микролитров формамида в раствор свежеприготовленной, нетронутой круговой ДНК, к окончательному объему 140 микролитров со смешиванием.
Загрузите от 16 до 20 микролитров кругового раствора ДНК в каждую из семи-девяти денатурированных гелеобразующих скважин PAGE. Смешайте два микролитров погрузочного красителя с восемью микролитров соответствующего предшественника линейной ДНК, и введите смесь в отдельный эталонный колодец. Затем запустите гель в течение двух часов на 10 вольт в сантиметре, останавливая бег, когда ксилен цианол FF можно наблюдать около двух третей вниз гель.
Надев резиновые перчатки и очки, перенесите гель на флуоресцентную тонкослойную хроматографическую пластину и используйте лезвие бритвы, чтобы отрезать полосы геля-мишени, затененные УФ-облучением. Поместите гель полосы в две миллилитровые микроцентрифуг трубки для сушки, затем пюре сушеные гели в пасту, и добавить де-ионизированной воды в два раза объем геля, для ночного встряхивания при комнатной температуре. На следующее утро, фильтровать смесь в две миллилитровые микроцентрифуг трубки, полоскания сторон первой трубки с небольшим объемом деионизированной воды для восстановления любых остаточных ДНК, и фильтрации снова объединить supernates.
Затем очистите круговую ДНК с помощью этанола осадков, и хранить ДНК при минус 20 градусов по Цельсию. Для одного горшка annealing, смешать два микролитера 10-кратного Tris ацетат EDTA магния буфера, один микролитр каждого 10 микромолярной ДНК фондовый раствор набора линейных и круговых нитей в равных соотношениях молар, и дополнительные Tris EDTA буфера в 200 микролитров ПЦР пробирки, до конечного объема 20 микролитров. Затем аннел сборочный раствор в тепловой бутылке от 95 до 25 градусов по Цельсию, в течение 48 часов.
Для двухступчатой аннеализации бесконечных решеток смешайте два микролитров 10-кратного буфера магния Tris acetate EDTA, один микролитр из каждых 10 микромолярной ДНК-фондового раствора набора линейных и круговых нитей в равных соотношениях молар, и дополнительный буфер Tris EDTA в 200 микролитровой пробирке PCR, до конечного объема в 20 микролитров. В первом этапе суб-плитки, anneal каждого предшественника суб-плитки решение в PCR термоциклер, используя быстрый метод линейного охлаждения от 95 до 25 градусов по Цельсию, в течение двух с половиной часов. Для подготовки решения сборки, для каждой из четырех бесконечных решетки, смешать 10 микролитров каждого из двух соответствующих суб-плитки решений вместе, до окончательной концентрации 0,25 микромолара для каждой нити.
Во втором шаге аннеалирования решетки, anneal 20 микролитровой смеси в pcR термоциклер, используя медленный метод охлаждения. Для двухступного аннальизации двух конечных прямоугольных решеток смешайте один микролитр из 10-кратного буфера магния Tris acetate EDTA, 0,5 микролитров каждого 10 микромолярского раствора ДНК в наборе линейных и круговых нитей в равных молярных соотношениях и дополнительный буфер Tris EDTA в 200 микролитровой пробирке PCR, до конечного объема в 10 микролитров. В первом шаге annealing, anneal каждый предшественник суб-плитки решение в PCR термоциклер, используя метод быстрого линейного охлаждения, как попродемонстрировано, от 95 до 25 градусов по Цельсию, в течение двух с половиной часов, и смешать annealed 32 суб-плитки решения, каждый с 2 микролитров, вместе в 200 микролитров ПЦР тест трубки, до конечного объема 64 микролитров.
Затем, во втором шаге annealing, anneal 64 микролитр смеси в термоциклер, используя метод медленного охлаждения, как попродемонстрировано. Для электрофорезной очистки конечных решеток приготовьте родной 2%agarose гель и загрузите 20 микролитров конечного раствора решетки в каждую колодец, а также добавление 5 микролитров 100-3000 базовых пар ДНК лестницы, в отдельный колодец. После запуска геля в течение двух часов на 5 вольт в сантиметре в ледяной водяной бане, сократить целевые полосы геля примерно на уровне 1000 базовый маркер пары под ультрафиолетовым светом, как попродемонстрировано, и нарезать гель полосы на мелкие кусочки.
Поместите измельченные гели в колонку фильтра и центрифуга колонки для извлечения решетки. Затем соберите раствор для визуализации атомной силовой микроскопии. Для конечной очистки решетки полиэтиленгликоль, или PEG, смешайте 50 микролитров конечного раствора решетки с равным объемом 15%PEG 8000 буфер, центрифуга раствор, и повторно приостановить гранулы в 100 микролитров буфера PEG, для дополнительной центрифугации.
После второй центрифугации, повторно приостановить гранулы в Tris ацетат EDTA магния буфера, для атомной микроскопии силы изображения. Для бесконечной 2D решетки атомной силы микроскопа изображения, расщеплять свежий слой слюды, и депозит двух микролитров annealed образца на чистую поверхность. Разрешить решетки ДНК две минуты, чтобы поглотить поверхность слюды, перед мытьем поверхности два раза, с 100 микролитров деионизированной воды на стирку, сушки поверхности с сжатым воздухом после второй стирки.
Чтобы получить изображения атомного микроскопа силы бесконечных решеток ДНК в воздухе, откройте режим касания в программном обеспечении изображения и установите размер сканирования до 0,5-5 микрометров, разрешение сканирования до 512 линий и скорость сканирования от одного до 3,5 Герца. Затем сканируйте поверхность слюды с помощью треугольных зондов атомного микроскопа. Для изображения конечных решеток ДНК, отлепите свежий слой слюды, как попродемонстрировано, и отложите 80 микролитров одного раза ацетат EDTA магния буфера на чистую поверхность слюды.
Затем добавьте пять микролитров конечных образцов в буфер и позвольте решеткам ДНК за две минуты впитаться в поверхность слюды, прежде чем добавить в зонд еще 50 микролитров буфера магния Tris acetate EDTA. Затем установите размер сканирования до 0,5-1 микрометра, разрешение сканирования до 256 линий и скорость сканирования до 1,5 Герца, прежде чем сканировать поверхность с помощью треугольных зондов, как это было продемонстрировано. Круговая ДНК движется немного медленнее, чем ее предшественник линейной ДНК в денатурации PAGE, потому что поры внутри круговой ДНК проникли и отсталых гель волокон.
Круговые 64 нуклеотидных сборочных семейств имеют только одну четкую и чистую полосу для каждой сборки, подтверждающую стабильность их мономерных мотивов. Однако круговые 84 нуклеотидных сборочных семейств плиток имеют мазки вокруг основных полос, что указывает на наличие незначительных подсыблечных продуктов. Независимо от минорных продуктов неправильных партнеров, отличные решетки с высокой урожайностью могут быть собраны из целевых мономерных мотивов.
Каждая сборка имеет свои морфологические особенности в микрометровой шкале, такие как нанопроводы, нанотрубки, наноспиралы, нанориббоны и наноректанглы. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы избежать, в частности, загрязнения мусора во время или вне ступенек. После его развития, этот метод проложил путь для исследований в области нанотехнологий ДНК, чтобы исследовать новых членов семьи некоторых более круговой нанотехнологии ДНК.
