Мы с крупной задолженностью, чтобы Джонатан Говард, чья группа разработала основной протокол для анализа скольжения моторики который впоследствии был адаптирован нами. Финансовая поддержка со стороны NSF гранта DMR0645023 это с благодарностью.

1.) Буферы и реагенты Эти решения должны быть подготовлены заранее и хранить в удобной размера порции. Аликвоту должна содержать достаточное решение для типичного эксперимента и свежей аликвоты должна использоваться для каждого моторики анализа. Условий хранения и типичные размеры аликвоту также упоминаются в следующих протоколов. 1. BRB80 буфера (80 мМ ТРУБЫ, 1 мМ MgCl 2, 1 мМ EGTA в деионизированной дистиллированной (день) воды, рН до 6,9 по КОН) <ul><li> Макияж 100 мл маточного раствора 0,5 М EGTA в воде дд. Отрегулируйте рН до 7,0 с использованием 2 М NaOH решение. </li><li> Макияж 100 мл исходного раствора 1 М MgCl 2 в воде дд. Автоклав решение. </li><li> Добавить 24,2 г труб и 3,1 г КОН гранул в приблизительно 800 мл воды, дд и размешать до растворения. Отрегулируйте рН до 6,9 с помощью 1 М КОН решение. Добавьте 2 мл 0,5 М EGTA маточного раствора и 1 мл 1 М MgCl 2 маточного раствора. Доведите до объема 1000 мл водой дд. </li><li> Алиготе в 50 мл труб сокола и замерзает при -20 ° C для дальнейшего использования. BRB80 трубки в настоящее время используется можно хранить при температуре 4 ° С или при комнатной температуре. </li></ul> 2. Хлорид магния, MgCl 2 (100 мМ в воде дд) <ul><li> Развести в воде дд для достижения конечной концентрации 100 мМ. </li><li> Алиготе (10 мкл) в 0,5 мл труб микроцентрифужных и храните при температуре от -20 ° C для дальнейшего использования </li></ul> 3. Гуанозин-5&#39;-трифосфата, динатриевая соль, ГТФ (25 мМ дд воды, рН до 7, NaOH) <ul><li> Взвесьте, и растворяются в воде дд и отрегулировать рН до 7, 2 М раствора NaOH. </li><li> Проверьте концентрацию путем измерения УФ-поглощению при 260 нм. (Использование коэффициента экстинкции 11,7 х 103 М -1 см -1). </li><li> Алиготе (10 мкл) в 0,5 мл труб микроцентрифужных и храните при температуре от -20 ° C для дальнейшего использования. </li></ul> 4. Диметилсульфоксид, ДМСО <ul><li> Алиготе (10 мкл) в 0,5 мл труб микроцентрифужных и храните при температуре от -20 ° C для дальнейшего использования. </li></ul> 5. Таксол (1 мМ в ДМСО) <ul><li> Взвесьте, и растворяется в ДМСО под вытяжным шкафом для достижения конечной концентрации 1 мМ. </li><li> Алиготе (20 мкл объема) в 0,5 мл труб микроцентрифужных и храните при температуре от -20 ° C для дальнейшего использования. </li></ul> 6. D-(+)-Глюкоза, (2 М в воде дд) <ul><li> Взвесьте, и растворяются в воде дд для достижения конечной концентрации 2 М. </li><li> Алиготе (20 мкл объема) в 0,5 мл труб микроцентрифужных и храните при температуре от -20 ° C для дальнейшего использования. </li></ul> 7. Глюкозооксидазы, (2 мг / мл в BRB80) <ul><li> Растворите в BRB80 для достижения конечной концентрации 2 мг / мл. </li><li> Алиготе (20 мкл объема) в 0,5 мл труб микроцентрифужных и храните при температуре от -20 ° C для дальнейшего использования. </li></ul> 8. Дитиотреитола, DVB-T (1 М дд воды) <ul><li> Растворите в воде дд под вытяжным шкафом для достижения конечной концентрации 1 М. </li><li> Алиготе (20 мкл объема) в 0,5 мл труб микроцентрифужных и храните при температуре от -20 ° C для дальнейшего использования. </li></ul> 9. Каталазы, (0,8 мг / мл в BRB80) <ul><li> Растворите в BRB80 по крайней мере в 2 этапа для достижения конечной концентрации 0,8 мг / мл. Определить концентрацию на каждом этапе путем измерения УФ-поглощению при 276 нм и 406 нм (Использование коэффициента экстинкции 3,1 · 10 5 М -1 см -1 при 276 нм и 2,2 х 10 5 М -1 см -1 при 406 нм и Уравнение = Cl). </li><li> Алиготе (20 мкл объема) в 0,5 мл труб микроцентрифужных и храните при температуре от -20 ° C для дальнейшего использования. </li></ul> 10. Аденозин-5&#39;-трифосфат, АТФ (100 мМ в 100mM MgCl 2) <ul><li> Подготовка исходного раствора 100 мМ MgCl 2 в воде дд. Взвесьте из сухой порошок и растворить в этой акции решением для достижения конечной концентрации 100 мм. </li><li> Проверьте концентрацию путем измерения УФ-поглощению при 260 нм. (Использование коэффициента экстинкции 15,4 х 10 3 М -1 см -1). </li><li> Алиготе (20 мкл объема) в 0,5 мл труб микроцентрифужных и храните при температуре от -20 ° C для дальнейшего использования. </li></ul> 11. Казеин раствор (20 мг / мл казеина в BRB80) <ul><li> Добавьте примерно 3 г казеина в 30 мл воды в дд 50 мл трубки сокола. Vortex в течение примерно 1 час, пока решение развивает густую консистенцию. </li><li> Центрифуга примерно в 15000 г в течение 30 минут. Фильтры супернатанта через 0,5 мкм и 0,2 мкм фильтры шприц. </li><li> Определить концентрацию супернатанта путем измерения УФ-поглощению при 280 нм (Использование коэффициента экстинкции 0,67 мл мг -1 см -1). Развести ее до 20 мг / мл в BRB80. </li><li> Алиготе (20 мкл объема) вдо 0,5 мл микроцентрифужных труб и хранить при -20 ° C для дальнейшего использования. </li></ul> 2.) Типовые Решения Они подготовлены на день эксперимента и должен быть уничтожен после того, эксперимент завершен. Подготовка 1 мл каждая. 1. BRB80CS0.5 <ul><li> Развести казеин решение в BRB80 до конечной концентрации 0,5 мг / мл и хранят на льду. Данное решение вводится в проточной ячейке до кинезин и помогает сохранить кинезин деятельность после поверхностной адсорбции. </li></ul> 2. BRB80CA <ul><li> Подготовка 0,2 мг / мл, казеина и 1 мМ АТФ в BRB80 и хранить на льду. Кинезин далее разбавляется с помощью этого решения до вступления в потоке клеток. </li></ul> 3. BRB80T <ul><li> Развести таксола решение в BRB80 в конечной концентрации 10 мкМ и хранить при комнатной температуре. Это решение используется для стабилизации микротрубочек. </li></ul> 4. BRB80CT <ul><li> Подготовка 10 таксола мкМ и 0,2 мг / мл казеина в BRB80 и хранить при комнатной температуре. Это используется для дальнейшей подготовки antifade и микротрубочек решений. </li></ul> 5. BRB80AF <ul><li> Подготовка 20 мМ D-глюкозы, 20 мкг / мл глюкозооксидазы, 8 мкг / мл каталазы, 10 мМ DTT, и 20 мкМ АТФ в BRB80CT и хранить при комнатной температуре. Это решение используется для разбавления стрептавидином и наносферы и &quot;вымывание&quot; избыток стрептавидином в потоке клеток. Скорость кинезин можно управлять, регулируя концентрацию АТФ в этом растворе. </li></ul> 3.) Кинезин подготовка <ul><li> Экспресс кинезин построить состоящий из дикого типа, полнометражные дрозофилы кинезин тяжелой цепи и С-концевой Его-тег в кишечной палочки и очистить использовании Ni-NTA колонке, как описано в 6. </li><li> Сделать аликвоты (10 мкл каждой) в 0,5 мл микроцентрифужных труб и хранить при температуре -80 ° C для дальнейшего использования. Концентрация активного кинезин в этих аликвоты приблизительно 200 нм. 7 </li><li> Для типичного эксперимента, развести раствор кинезин 20 раз в BRB80CA. Этикетка KIN20 решение и хранить на льду. </li></ul> 4.) Микротрубочек подготовка <ul><li> В трубке микроцентрифужных 0,5 мл, подготовить 25 мкл роста решения: 4 мМ MgCl 2, 1 мМ GTP и 5% ДМСО (об. / об) в BRB80 буфера. </li><li> Добавить 6,25 мкл этого раствора до 20 мкг аликвоту лиофилизированный биотинилированного тубулина. </li><li> Vortex, затем поместить в термостате при температуре 37 ° С в течение 30 минут к полимеризации. Развести в 100 раз в BRB80T и вихревые мягко. Этикетка MT100 решение и хранить при комнатной температуре. </li><li> Сделать 10 раз разбавления MT100 в BRB80AF. Этикетка решение MT1000. </li></ul> 5.) Стрептавидином и наносферы решения Подготовка AlexaFluor568 меченных стрептавидин в концентрации 100 нМ в BRB80AF. Этикетка это STV100 и хранить на льду. Аналогично, развести наносферы 5000 раз в растворе BRB80AF. Этикетка это NS5000 и хранить на льду. 6.) Расход сотового Строительство Построить проточной ячейкой с помощью двух стеклянных покровных разделенных двухсторонней ленты. Этот поток ячейки составляет примерно 2 см в длину, 1 см в ширину и 100 мкм, высокая, и имеет объем около 20 мкл. Решения вводятся в проточной ячейке с одной стороны с помощью пипетки и злой из друга с помощью фильтровальной бумаги. 7.) Перевернутый Ассамблеи Пробирной Стекло поверхность покрыта первым казеин, который позволяет кинезин сохранять свою функциональность при адсорбции. После кинезин адсорбируется, микротрубочки вводятся, которые проводятся по кинезин. Микротрубочки затем покрытые флуоресцентной стрептавидином. После вымывания избыточного стрептавидин, биотинилированного полистирола флуоресцеина наносфер (40 нм в диаметре) вводятся. Поверхность адсорбированных стационарных наносферы столкнуться с движущимся микротрубочек и загружаются на них (рис. 1). Порядок поток решений и время до введения следующему решению перечислены ниже. <ul><li> BRB80CS0.5, 5 минут </li><li> KIN20, 5 минут </li><li> MT1000, 5 минут </li><li> STV100, 5 минут </li><li> BRB80AF, 3x </li><li> NS5000 </li></ul> 8.) Микроскопии Горы проточной ячейки на столике микроскопа сразу же после введения наносферы. В этом эксперименте Затмение TE2000-U флуоресцентного микроскопа (Nikon, Мелвилл, штат Нью-Йорк), оснащенных 100X цель нефти (NA 1,45), X-Cite 120 ламп (EXFO, Онтарио, Канада) и IXON EMCCD камеры (ANDOR, Юг Виндзор, штат Коннектикут) была использована. FITC фильтр куб (# 48001) и TRITC куб фильтра (# 48002, Chroma технологий, Рокингем, VT) были использованы для изображения наносферы и микротрубочки respectiВели на нижней поверхности потока клеток. Время экспозиции 0,2 с, а время между экспозициями было 2 с <img src="/files/ftp_upload/2006/2006fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Схематическое изображение молекулярной челноков.

<ol>
	<li>Agarwal, A., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+motors+at+the+intersection+of+nanotechnology+and+polymer+science.">Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science.</a> Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).</li><li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules.">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).</li><li>Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond+curing+time+of+a+molecular+adhesive+causes+velocity-dependent+cargo-loading+of+molecular+shuttles.">Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles.</a> Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).</li><li>Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+and+Transporting+DNA+Molecules+Using+Motor+Proteins.">Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins.</a> Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).</li><li>Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+transport+of+nanocrystal+CdSe+quantum+dot+nanocomposites+using+microtubules+and+kinesin+motor+proteins.">Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins.</a> Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).</li><li>Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+takes+one+8-nm+step+for+each+ATP+that+it+hydrolyzes.">Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes.</a> J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).</li><li>Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -. Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+performance+of+protein-resisting+surfaces+at+ultra-low+protein+coverages+using+kinesin+motor+proteins+as+probes.">Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes.</a> Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).</li><li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination.">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).</li><li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices.">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

С незначительными изменениями этот протокол был успешно используется различными группами, чтобы собрать кинезин-микротрубочек основан анализов подвижности. 10 мМ DTT в окончательном решении моторики может быть заменен на 0,5% β-меркаптоэтанола. Стандартные решения (BRB80AF, KIN20 и MT1000) больше,...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Adenosine-5&#x2019;-triphosphate (ATP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A1049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin tubulin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cytoskeleton Inc.</td>
<td>T333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Casein</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C-0376</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C-9322</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-(+)-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G-7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D-8779</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithiotreitol (DTT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-0610</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#x2032;,N&#x2032;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E-4378</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F-8766</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose oxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G-7016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Guanosine-5&#x2019;-triphosphate (GTP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostic</td>
<td>106399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>63069</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paclitaxel (Taxol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T1912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#x2032;-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P-6757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P-6310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>480878</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S11226</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

cargo loading onto kinesin powered molecular shuttles

Клетки развивались сложные молекулярные машины, такие как кинезин моторных белков микротрубочек и нитей, для поддержки активного внутриклеточного транспорта грузов. Хотя кинезины хвост домен связывается с различными грузами, домены кинезины голову использовать химическую энергию, запасенную в молекулах АТФ, чтобы шаг по микротрубочек решетки. Длинные, жесткие микротрубочки служат треков для дальних внутриклеточного транспорта. Эти двигатели и нити могут быть также использованы в microfabricated синтетических средах в качестве компонентов молекулярных челноков 1. В часто используемых дизайн, кинезин двигатели крепятся к поверхности трассы через их хвосты, и функциональных микротрубочки служат в качестве груза несущих элементов, которые в движение с помощью этих двигателей. Эти челноки могут быть загружены с грузом, используя сильное и избирательное связывание между биотином и стрептавидином. Ключевых компонентов (биотинилированного тубулина, стрептавидина и биотинилированного груза) имеются в продаже. Опираясь на классическое перевернутой анализа подвижности 2, строительство молекулярные челноки подробно здесь. Кинезин моторных белков адсорбируются на поверхности предварительно нанесенным покрытием с казеина; микротрубочки полимеризуются с биотинилированного тубулина, придерживались кинезин, а затем покрыты родамин-меченого стрептавидином. Концентрации АТФ поддерживается на subsaturating концентрации, чтобы достичь скорости скольжения микротрубочек оптимальным для погрузки груза 3. Наконец, биотинилированного флуоресцеина меченых наносферы добавляются в качестве груза. Наносфер, придают микротрубочек в результате столкновений между микротрубочек скольжение и наносфер присоединения к поверхности. Протокол может быть легко изменены, чтобы загружать как различные грузы, такие как ДНК биотинилированного 4, квантовые точки, 5 или разнообразных антигенов с помощью антител биотинилированного 4-6.

Watch this Scientific Journal Video about Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles at JoVE.com

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Молекулярные челноки, состоящий из микротрубочек функционализированных скользит по поверхности, придерживался кинезин моторных белков могут служить в качестве наноразмерных транспортной системы. Здесь, сборка типичной системе трансфер описывается.

Погрузка на грузовые кинезин Powered молекулярной Автобусы

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

cargo-loading-onto-kinesin-powered-molecular-shuttles

Research

JoVE Journal

Biology

10.4K Views.  University of Florida. Молекулярные челноки, состоящий из микротрубочек функционализированных скользит по поверхности, придерживался кинезин моторных белков могут служить в качестве наноразмерных транспортной системы. Здесь, сборка типичной системе трансфер описывается.

Video: Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace. Most are associated with repetitive, high force hand activities. The mechanisms of cellular and structural damage due to cyclical loading are not well known. The purpose of this video is to present a new system that can simultaneously load four tendons in tissue culture. The video describes the methods of sterile tissue harvest and how the tendons are loaded onto a clamping system that is subsequently immersed into media and maintained at 37&deg;C. One clamp is fixed while the other one is moved with a linear actuator. Tendon tensile force is monitored with a load cell in series with the mobile clamp. The actuators are controlled with a LabView program. The four tendons can be repetitively loaded with different patterns of loading, repetition rate, rate of loading, and duration. Loading can continue for a few minutes to 48 hours. At the end of loading, the tendons are removed and the mid-substance extracted for biochemical analyses. This system allows for the investigation of the effects of loading patterns on gene expression and structural changes in tendon. Ultimately, mechanisms of injury due to overuse can be studies with the findings applied to treatment and prevention.

A new in vitro system for simultaneously loading four tendons in culture is described.

Экс естественных механические нагрузки сухожилия

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as the messenger essential for the synaptic plasticity that supports learning and memory. To further elucidate the molecular underpinnings of Ca2+-dependent synaptic mechanisms, a model system is required that is both genetically malleable and physiologically accessible. Drosophila melanogaster provides such a model. In this system, genetically-encoded fluorescent indicators are available to detect Ca2+ changes in nerve terminals. However, these indicators have limited sensitivity to Ca2+ and often show a non-linear response. Synthetic fluorescent indicators are better suited for measuring the rapid Ca2+ changes associated with nerve activity. Here we demonstrate a technique for loading dextran-conjugated synthetic Ca2+ indicators into live nerve terminals in Drosophila larvae. Particular emphasis is placed on those aspects of the protocol most critical to the technique's success, such as how to avoid static electricity discharges along the isolated nerves, maintaining the health of the preparation during extended loading periods, and ensuring axon survival by providing Ca2+ to promote sealing of severed axon endings. Low affinity dextran-conjugated Ca2+-indicators, such as fluo-4 and rhod, are available which show a high signal-to-noise ratio while minimally disrupting presynaptic Ca2+ dynamics. Dextran-conjugation helps prevent Ca2+ indicators being sequestered into organelles such as mitochondria. The loading technique can be applied equally to larvae, embryos and adults.

Calcium is a ubiquitous messenger in the nervous system, essential for triggering neurotransmitter release and changes in synaptic strength. Here we demonstrate a technique for loading Ca2+-indicators into Drosophila nerve terminals. We also demonstrate fabrication of the required apparatus and emphasize points critical for the technique's success.

Загрузка дрозофилы нервными окончаниями с кальцием Индикаторы

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within the LTR sequences of the HIV-1 provirus, resulting in the excision and eradication of the provirus from infected human cells. 
We started with Cre, a 38-kDa recombinase, that recognizes a 34-bp double-stranded DNA sequence known as loxP. Because Cre can effectively eliminate genomic sequences, we set out to tailor a recombinase that could remove the sequence between the 5'-LTR and 3'-LTR of an integrated HIV-1 provirus. As a first step we identified sequences within the LTR sites that were similar to loxP and tested for recombination activity. Initially Cre and mutagenized Cre libraries failed to recombine the chosen loxLTR sites of the HIV-1 provirus. As the start of any directed molecular evolution process requires at least residual activity, the original asymmetric loxLTR sequences were split into subsets and tested again for recombination activity. Acting as intermediates, recombination activity was shown with the subsets. Next, recombinase libraries were enriched through reiterative evolution cycles. Subsequently, enriched libraries were shuffled and recombined. The combination of different mutations proved synergistic and recombinases were created that were able to recombine loxLTR1 and loxLTR2. This was evidence that an evolutionary strategy through intermediates can be successful. After a total of 126 evolution cycles individual recombinases were functionally and structurally analyzed. The most active recombinase -- Tre -- had 19 amino acid changes as compared to Cre. Tre recombinase was able to excise the HIV-1 provirus from the genome HIV-1 infected HeLa cells (see "HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase", Hauber J., Heinrich-Pette-Institute for Experimental Virology and Immunology, Hamburg, Germany). While still in its infancy, directed molecular evolution will allow the creation of custom enzymes that will serve as tools of "molecular surgery" and molecular medicine.

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within the LTR sequences of the HIV-1 provirus, resulting in the excision and eradication of the provirus from infected human cells. While still in its infancy, directed molecular evolution will allow the creation of custom enzymes that will serve as tools of molecular surgery and molecular medicine.

Молекулярная эволюция Tre рекомбиназы

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF plates to feeder cell-free Matrigel plates.


This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 2 of 3.

С MEFs к Матригель 2: Разделение ЭСК из MEFs на Матригель

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated.

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 3 of 3.

С MEFs к Матригель 3: пассажи из ЭСК Матригель на Матригель

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Ассамблея, Загрузка и согласование аналитической сотовый Пример ультрацентрифуге

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Выделение и очистка от кинезин Drosophila Эмбрионы

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

Прямое изображение ЭР кальция с целевыми-эстеразы Индуцированные красителем (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.

Generating a &quot;Humanized&quot; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.

Создание &quot;гуманизированные&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2 клеточной линии Чувствительные к фармакологическим ингибирование Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

Идентификация Kinesin-1 Грузы с помощью флуоресцентной микроскопии

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...